circRNA和m6A两大热点如何一起研究？这篇文章给你一个研究模板！
RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而m6A是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的。m6A修饰主要发生在RRACH（R=G,A;H=A，C或U）序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器（Writer）”、“消码器（Eraser）”、和“读码器（Reader）”决定。
最近关于m6A甲基化的研究，热度持续不减。那么，站在这个风口上，如何把自己的研究做到脱颖而出呢？
下面就给大家介绍一篇文章：
中文标题：circNSUN2的m6A甲基化修饰促进HMGA2 mRNA细胞质稳定和输出，从而促进大肠癌的肝转移。
文章发表于Nature Communications杂志，2019 年IF：12.121
已有报道m6A修饰广泛存在于circRNA中。但m6A修饰对circRNA的影响与调控机制及其在肿瘤进展中的生物学意义尚不清楚。作者立位于circRNA，发现m6A修饰的circNSUN2可结合YTHDC1并促进其出核，进一步结合IGF2BP2，稳定HMGA2 mRNA，从而促进结直肠癌肝转移。如图。
下面带大家看一下图片逻辑和实验结果:
1.circNSUN2的表达分析
文章先是通过高通量circRNA微阵列，分析CRC（结直肠癌）和邻近非肿瘤组织样本，鉴定出了38种调节异常的circRNA，并选取9个有统计学意义且循环失调的环状circRNAs作为候选。
随后，qRT-PCR分析发现：其中4种circRNA在超过75%的标本中呈现出高表达的趋势，且circNSUN2高表达组的生存状况显著低于低表达组。
circNSUN2进入考察范围！
接着，又通过对正常组织、CRC未转移、CRC肝转移（LM）临床样本中circNSUN2的表达进行分析，发现：
结直肠癌肝转移患者的癌组织与血清中，circNSUN2的显著高表达异常。
至于为什么要做血清么。。。你把circRNA当肿瘤分子标记物研究，你不看它在无创诊断血里的表达丰度未必还等着穿刺活检组织来给它染FISH吗！？
2.CRCs中circNSUN2的鉴定
接下来，有circRNA研究经验的小伙伴们一定知道，就是必须要有的circRNA验证环节啦：
1.序列：RT-PCR-Sanger测序，验证circNUSN的环状序列；
2.结构：对RNase R外切酶的耐消化性证实，验证circNUSN具有环状RNA结构；
3.稳定性：Northern印迹区分circNSUN2及其NSUN2转录本，随后qRT-PCR分析：转录抑制剂放线菌素D处理后，circNSUN2的半衰期超过24小时，而相关线性转录本的半衰期则约为4小时；说明了：circNSUN2比线性化的mSUN2在CRC细胞中更加稳定；
4.胞内分布：核质分离和荧光原位杂交检测显示：circNSUN2主要分布在胞质中。
circNSUN2是CRC中表达丰富而稳定的circRNA，主要分布在胞浆。
友善提醒：以上circRNA的序列、结构、稳定性、分布检测堪称经典模范。需要发JCR一区文章的小伙伴学起来，circRNA的这些鉴定缺一不可！就算投出去没被拒，亲爱的Reviewer们还是会让你补哒~~！
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3.CircNSUN2促进PDX模型中的CRC细胞转移
接下来，文章直接在动物体内来验证circSUN2的功能。作者直接上的PDX模型，一记绝杀胜过所有体外细胞功能学实验和体内皮下or尾静脉成瘤验证！
在PDX CRC细胞中，circNSUN2表达下调后，无论是在肝脏（a）还是肺（c）转移模型中，肿瘤转移均受到明显抑制；
相比之下，通过过表达circNUSN2注入TC71细胞的裸小鼠与对照组相比，肝脏（b）或肺（d）的转移性结节明显增多；
表明：CRC转移的调节作用直接来自circNSUN2 。
4.YTHDC1促进m 6 A修饰的circNSUN2的细胞质输出
对于高分文献来说，分子机制不可或缺：
首先，作者使用RNA pull down和质谱分析筛选与circNSUN2相互作用的蛋白：YTHDC1和IGF2BP2作为拟定的circNSUN2结合蛋白；RIP的结果也进一步的验证。
而YTHDC1是已知的m6A读码器，检测circNSUN2是否含有m6A甲基化就很有必要啦！
通过m6A RIP分析：circNSUN2的外显子5’和外显子4’连接序列在m6A的析出分数中得到了高度富集；证实了circNSUN2中的m6A修饰。
而序列分析也预测到了circNSUN2中存在GAACU motif；再通过EMSA实验：当RNA探针中GAACU m6A基序或YTHDC1的m6A结合基序发生突变，YTHDC1与circNSUN2的相互作用能力下降。
核质分离和荧光原位杂交检测也提示：YTHDC1的沉默显著增加了细胞核circRNA的含量。
总之，这些结果证明：
YTHDC1可以与circNSUN2结合，从而促进circNSUN2以m6A依赖的方式从 细胞核向细胞质输出。
从这张fig开始作者就开始秀他的花式分子互作技术了，贴心的小编已经为你标记出了所有用到的实验方法，需要了解这些技术的可以加微信详聊。
5.CircNSUN2通过CAUCAU基序与IGF2BP2相互作用
验证了YTHDC1，再来验证IGF2BP2，一个具有促进mRNA稳定性的蛋白。
RNA pull down和RIP实验：IGF2BP2与circNSUN2之间存在相互作用；
同时，荧光原位杂交检测也提示胞质中内源性表达的circNSUN2和IGF2BP2共定位；
这些结果表明：
circNSUN2/IGF2BP2在细胞质中形成了RNA蛋白复合物。
另外，作者还研究了IGF2BP2与circNSUN2相互作用的结构域：
通过对不同结构域片段的RIP分析：IGF2BP2的KH3-4-di-domain特异性地与circNSUN2结合；
已有报道IGF2BP2结合RNA的motif是CAUH （H = A、U或C），在circNSUN2中存在该基序。而基于位点突变前后EMSA分析表明：circNSUN2内的CAUCAU是IGF2BP2相互作用所必需的。
总之，
IGF2BP2通过KH3-4-di-domain与circNSUN2的CAUCAU结合。
6.circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2复合物促进HMGA2 mRNA稳定
众所周知，作为“读码器”，IGF2BP2对mRNA的稳定性至关重要。那circNSUN2/IGF2BP2复合物是否能稳定某些未知的下游靶点呢？
文章在补充图中设计了干扰circNSUN2前后分析转录组的差异情况：644个mRNA表达在circNSUN2沉默后显著下降。再基于已发表的CLIP数据分析了这644种mRNA的情况，其中有21种mRNA可以结合IGF2BP2。考虑到circNSUN2促进了转移进程，结合qRT-PCR和WB验证，证实了HMGA2是circNSUN2的靶点。
而RNA pull down实验也证实circNSUN2和HMGA2之间的相互作用；在干扰circNSUN2后HMGA2的mRNA稳定性显著降低；
双荧光素酶：敲除circNSUN2可以显着抑制荧光素酶HMGA2- WT的mRNA表达和荧光素酶活性；
RNA-FISH：HMGA2和IGF2BP2共定位在细胞质中。在没有circNSUN2的情况下，HMGA2 / IGF2BP2 RNA-蛋白质复合物的共定位显着降低，而IGF2BP2的表达未改变；
以上提示：
circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2以复合物的形式发挥作用。
RIP分析表明：IGF2BP2的KH3-4双结构域是其与circNSUN2和HMGA2相互作用所必需的；且敲除circNSUN2可显着降低HMGA2/ IGF2BP2 RNA-蛋白质相互作用，而异位表达circNSUN2则明显增加了IGGA2BP2免疫沉淀级分中HMGA2的富集度。
以上提示：
circNSUN2在促进IGF2BP2与HMGA2相互作用方面起着关键作用，并通过形成circNSUN2/ IGF2BP2/HMGA2 RNA蛋白三元复合物来提高HMGA2的 mRNA稳定性。
7.circNSUN2通过HMGA2途径促进CRC肝转移
最后，作者回归体内动物实验和临床组织的验证，通过体内模型表明：干扰circNSUN2可抑制肝转移，但同时过表达HMGA2则促进肝转移。
通过注射circNSUN2-nockdown PDX CRC细胞形成的肝脏中转移性结节减少，通过HMGA2的过表达而得以很大程度上恢复；
Transwell、3D反向入侵分析和3D培养体外分析进一步证明:干扰circNSUN2可抑制肝转移，但同时过表达HMGA2则促进肝转移；
为了揭示circNSUN2在CRC中的临床相关性：文章通过检测97例CRC患者中circNSUN2和HMGA2的表达水平：HMGA2的表达水平与circNSUN2的转录水平呈正相关；
检测20例CRC患者原发性和肝转移组织中HMGA2的表达水平：HMGA2的表达上调在肝转 移中比在原发性组织中更为普遍。
以上可得出结论：
circNSUN2通过HMGA2途径促进CRC肝转移。
到此，文章的主图结果全部解读完毕。
总结：
1.circNSUN2与细胞核内m6A结合蛋白YTHDC1结合，并且YTHDC1以m6A依赖的方式调控circNSUN2的出核定位；
2.胞浆circNSUN2可与RNA结合蛋白IGF2BP2结合，并能直接结合下游HMGA2 mRNA，形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元复合物，促进HMGA2 mRNA稳定性；
3.circNSUN2通过促进HMGA2mRNA的稳定性进而最终促进结直肠癌肿瘤的肝转移。