重度免疫缺陷小鼠探究过继性NK细胞疗法

CRC简介

结直肠癌（colorectal cancer, CRC），是全球女性中第二常见，男性中第三常见的癌症，也是全球第三大与癌症相关的死亡因素。CRC的发生是由一些关键基因的突变积累所致，包括CTNNB1、BRAF、PIK3CA、PDGFRL、TP53、APC等[1]。肿瘤转移（metastasis）是CRC患者死亡的主要原因。最常见的转移部位是肝脏，此外也有肺和腹膜的转移。CRC在男性和女性中都很普遍，且50岁后患病风险显著增加[2]。绝大多数CRC是由结直肠内壁形成的息肉（colorectal polyps）发展而来，因此，做结肠镜筛查十分重要，其能检测出结直肠中有无异常结构（例如息肉），是目前预防CRC最有效的方法。如果在早期阶段发现CRC，只需手术切除肿瘤即可；但如果在晚期阶段发现，通常需要用到化疗、放疗或靶向药物联合治疗。

Notice

建议大家从50岁起定期筛查CRC，早发现，早治疗~

CRC与EGFR

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤的进展中起重要作用。Spano等人的研究表明CRC患者中EGFR的过表达与肿瘤-淋巴结转移（tumor–node–metastasis，TNM） T3期显著相关[3]。

靶向EGFR的单抗，例如西妥昔单抗（cetuximab，CET），已被批准在晚期CRC患者中使用。这些单抗能阻碍EGFR与其配体EGF的结合，抑制其下游信号通路的激活，从而延长CRC患者的生存期。但与此同时，CRC患者EGFR信号通路中的一些关键的抑癌基因（tumour suppressor genes）和原癌基因（oncogenes）常常存在突变，例如RAS和BRAF等。这些突变的存在导致EGFR单抗治疗效果显著下降。

Case study：在荷瘤BRGS小鼠中移植人源UCB-NK进行治疗

尽管上天给EGFR单抗半掩了一下门，但研究者们发现了一扇窗户：除了可以阻断肿瘤细胞上EGFR与EGF的结合外，EFGR单抗也可以通过与NK细胞相互作用，激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC） ，对肿瘤细胞进行杀伤。但是有研究表明，尽管CRC组织中的趋化因子和细胞因子水平很高，但不管是哪个疾病阶段的CRC组织，其中浸润的NK细胞都很少[4]。因此Veluvhamy等人开始研究通过将人脐带血干细胞来源的NK细胞（umbilical cord blood stem cell-derived NK cells，UCB-NK）过继性转移（adoptive transfer）至荷瘤的重度免疫缺陷小鼠体内，观测UCB-NK单独以及与CET联合给药对带有RAS突变的肿瘤的治疗效果[5]。

在体内实验中，研究者们使用了缺乏功能性T、B、NK细胞，且转入了NOD背景Sirpa的BALB/c Rag2–/– Il2rg–/– SirpaNOD（BRGS）重度免疫缺陷小鼠（BRGSF小鼠的前身），并将带有荧光标签、表达EGFR，且RAS基因带有突变（EGFR+ RASmut），同时对CET有抗性的SW480人结肠腺癌细胞通过尾静脉接种至小鼠体内，给予不同的治疗（图1）。结果显示，CET单药并无明显抗肿瘤效果（蓝线），但是单独使用UCB-NK细胞治疗则可显著降低肿瘤负荷（绿线）。此外，值得注意的是，CET联合UCB-NK细胞并不能增加抗肿瘤效应，这说明CET并不能有效激活UCB-NK的ADCC效应，但同时，这也进一步证实了CET治疗携带RAS突变肿瘤的无效性。

图1. UCB-NK具有显著的抗肿瘤效果[5]。

此外，在移植SW480肿瘤细胞后第35天的荧光活体成像结果也显示，对比阴性对照组和CET单药组的小鼠，单独给予UCB-NK或UCB-NK和CET联合治疗的小鼠体内肿瘤生长受到明显抑制。另外，为了证明CET单药的疗效，研究人员也在BRGS小鼠体内接种了带荧光标签、过表达EGFR，且携带野生型RAS基因（EGFR+++RASwt）的A431人皮肤鳞癌细胞。结果显示，CET对EGFR+++RASwt的肿瘤细胞系具有强效的杀伤作用。

图2. 荧光活体成像结果显示UCB-NK具有显著的抗肿瘤效果[5]。

另外，小鼠生存曲线结果也显示，UCB-NK治疗能显著延长SW480（具有CET抗性且携带RAS突变的肿瘤）荷瘤小鼠的生存期。但CET联合UCB-NK细胞治疗相对于UCB-NK单独治疗并没有显著差异性。

图3. UCB-NK治疗能显著延长荷瘤（具有CET抗性且携带RAS突变的肿瘤）小鼠的生存期[5]。

综上，实验结果表明，在体内，UCB-NK对CRC细胞具有显著的抗肿瘤效果，且该效果在EFGR下游通路蛋白RAS突变后依然存在。这为携带RAS突变的CRC患者带来了新的治疗希望。

小结

过继性NK细胞疗法是一种非常有前景的细胞疗法。与T细胞疗法相比，其具有以下几个优点：

①更高的安全性：自体（autologous）移植时基本不产生细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性，而在同种异体（allogenic）移植时，基本不产生移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD）；

②具有多种机制来激活细胞毒性功能；

③由于发生GvHD的风险低，NK细胞治疗可以使用同种异体的NK细胞，这极大的拓宽了免疫治疗细胞的来源，提高了治疗可行性[6]。

那么如果要对过继性NK细胞疗法进行抗肿瘤效果的体内研究，我们应该如何选择小鼠模型呢？首先，我们需要明确NK细胞的来源：如果你所用的NK细胞是小鼠来源的，那么一般你可以选择相同遗传背景的，免疫系统功能健全的，荷有鼠源肿瘤的小鼠（syngeneic tumor model）[7]，又或者是荷有鼠源肿瘤的免疫缺陷小鼠[8]；如果你所用的NK小鼠是人源的，那么一般你可以选择荷有人源肿瘤的免疫缺陷小鼠（参考本文中的case study），又或者是移植了人CD34+造血干细胞的，荷有人源肿瘤的免疫系统人源化小鼠[9]。