MPB：山大倪金凤组-​黄翅大白蚁后肠几丁质降解微生物的分离与培养

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图 1. 8株几丁质降解菌的培养特征二、16S rRNA序列分析纯化后的菌株，通过16SrRNA基因测序，然后对其序列进行比对分析，发现它们属于不同属的菌株。它们分别与Flavobacterium oceanosedimentum，Dactylosporangium salmoneum，Brevibacillus borstelensis，Sphingomonas koreensis，Paenibacillus odorifer，Cellulomonas flavigena，Stenotrophomonas panacihumi和Bacillus cereu 相似度最高，相似度均大于97%(表1)。其中黄杆菌属Flavobacterium、指孢囊菌属Dactylosporangium和纤维单胞菌属Cellulomonas属于放线菌菌门，鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas和寡养单胞菌属Stenotrophomonas属于变形菌门，短芽孢杆菌属Brevibacillus、类芽孢杆菌属Paenibacillus和芽孢杆菌属Bacillus属于厚壁菌门 (图2)。表1. 8 株几丁质降解菌16S rRNA 的序列在GenBank中的比对结果菌株编号Strains相似性最高菌株Most similar strain in NCBIGenBank登录号Accession number相似性Similarity (%)chi-1Flavobacterium oceanosedimentumEF59257799.7chi-2Dactylosporangium salmoneumFJ97360799.5chi-3Brevibacillus borstelensisD7845698.2chi-4Sphingomonas koreensisAF13129698.3chi-5Paenibacillus odoriferCP00942899.5an-chi-1Cellulomonas flavigenaCP00196498.3an-chi-2Stenotrophomonas panacihumiGQ85621799.6an-chi-3Bacillus cereusAE01687799.4

图2. 分离纯化的8株几丁质降解菌基于16S rRNA基因序列构建的进化树注意事项1.胶体几丁质配制呈酸性会导致配制失败，因而需不断的用去离子水冲洗几丁质沉淀，将其洗至pH为中性7.0。2.采集到的白蚁材料尽量在新鲜状态下立即解剖，以保证几丁质降解菌的分离效果。3.在解剖白蚁前，清洗消毒白蚁体表，以防止体外菌的污染。4.解剖过程中镊子夹住白蚁头部，用解剖针从尾部缓缓拉出肠道，以保持肠道的完整性。溶液配方1.PBS 缓冲液NaCl 4 g，KCl 0.1 g，Na2HPO4 0.72 g，NaH2PO4 0.12 g，加入灭菌去离子水至终体积为500 ml，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.4。2.胶体几丁质称取10 g 几丁质粉末缓慢加入100 ml 盐酸中，4 °C、150 r/min 摇床振摇1 h，使几丁质完全溶解。放于4 °C 冰箱中静置24 h，加入5 倍体积的50%乙醇 (体积比) 静置5 h，加蒸馏水定容至1 L，室温条件下10,000 r/min离心 10 min，弃上清液，用去离子水将沉淀反复冲洗至pH为7.0，配置溶液终浓度为50 g/L，4 °C冰箱保存备用。3.固体几丁质培养基胶体几丁质200 ml，FeSO4·7H2 O 0.01g，MgSO4·5H2O 0.5 g，胰蛋白胨1 g，ZnSO4 0.01 g ，KH2PO4 0.3 g，MnCl2 0.01 g，K2HPO4 0.7g，琼脂18 g，加蒸馏水定容至1 L。121°C，高压蒸汽灭菌20 min。4.LB液体培养基NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 L。121°C，高压蒸汽灭菌20 min。致谢本项目获得国家重点基础研究发展计划 (973计划, 编号：2011CB707402)，国家自然科学基金 (编号：31970119, 31272370, 30870085) 及山东大学微生物技术国家重点实验室自主设置课题的支持。依据本实验方案我们从培菌白蚁肠道中分离到几丁质降解菌，并发现鉴定到一个新菌种 (孙新新等，2017; Sun等，2018)。参考文献1.Aanen, D. K., de Fine Licht, H. H., Debets, A. J., Kerstes, N. A., Hoekstra, R. F. and Boomsma, J. J. (2009). High symbiont relatedness stabilizes mutualistic cooperation in fungus-growing termites. Science 326(5956): 1103-1106.2.Ni, J. and Tokuda, G. (2013). Lignocellulose-degrading enzymes from termites and their symbiotic microbiota. Biotechnol Adv 31(6): 838-850.3.Poulsen, M. (2015). Towards an integrated understanding of the consequences of fungus domestication on the fungus-growing termite gut microbiota. Environ Microbiol. 17(8): 2562-2572.4.Sun, X., Li, J., Du, J., Xiao, H. and Ni, J. (2018). Cellulomonas macrotermitis sp. nov., a chitinolytic and cellulolytic bacterium isolated from the hindgut of a fungus-growing termite. Antonie Van Leeuwenhoek 111(3): 471-478.2.孙新新, 李净净, 宁娜, 谭慧军 and 倪金凤 (2017). 黄翅大白蚁后肠几丁质降解微生物的分离与鉴定. 微生物学通报 44 (7): 1649-1654