Nat Nanotechnol：脂质体介导检测血浆中SARS-CoV-2RNA阳性的细胞外囊泡

血浆SARS-CoV-2 RNA可能代表呼吸道RNA水平的可行诊断替代方案，呼吸道RNA水平在感染后迅速下降。定量RT-qPCR对血浆表现出较差的性能，这可能反映了释放到循环中的病毒RNA的稀释和降解，但这些问题可以通过分析包装到细胞外囊泡中的病毒RNA来解决。近日，美国杜兰大学（Tulane University）胡晔（Tony Ye HU）教授团队在Nature Nanotechnology杂志上发表文章，描述了一种测定方法，将直接从血浆中捕获的细胞外囊泡与载有试剂的脂质体融合，以灵敏地放大和检测SARS-CoV-2基因靶标。这种方法准确地识别了COVID-19患者，包括RT-qPCR遗漏的具有挑战性的病例。在感染后第1天检测到SARS-CoV-2阳性细胞外囊泡，并在非人类灵长类动物模型中从第6天到第28天趋于稳定，而在幼儿中观察到信号持续时间为20-60天。这种纳米技术方法使用非传染性样本并扩展病毒检测窗口，提供了一种工具来支持对呼吸道中检测不到SARS-CoV-2 RNA的患者进行COVID-19诊断。

呼吸道样本的RT-qPCR分析是COVID-19诊断的金标准，但它有局限性。感染后上呼吸道中的SARS-CoV-2 RNA水平迅速下降，而下呼吸道水平保持高位。因此，在早期SARS-CoV-2感染后进行的RT-qPCR检测可能会产生假阴性，但感染事件通常不清楚，使解释复杂化。鼻咽组织高度表达血管紧张素转换酶 2，这是SARS-CoV-2的主要受体，但该蛋白也在其他组织（例如心脏和小肠）中表达。因此，鼻咽RT-qPCR检测结果可能无法准确反映下呼吸道或肺外感染的状态。

在轻度至重度COVID-19中可检测到的循环SARS-CoV-2 RNA与疾病严重程度相关并可以预测，并且似乎是导致肺外感染的原因。然而，RT-qPCR对血浆中的SARS-CoV-2 RNA的总体敏感性较差（≤41%）。因此，与常规临床测试兼容的更灵敏、更强大的基于血液的SARS-CoV-2RNA检测可以改善COVID-19的诊断和预后评估。然而，只有两项不适合临床使用的液滴数字RT-PCR研究使用超灵敏方法检测血清或血浆中的SARS-CoV-2 RNA。

受感染的细胞可以分泌含有病原体衍生因子的细胞外囊泡 (EVs)，保护这些因子免受水解酶的影响，并允许它们在循环中积累。甲型和丙型肝炎可以通过EV介导的病毒基因组转移来感染细胞，这表明SARS-CoV-2可能使用类似的机制。因此，这种载有病毒的EV可能作为全身病毒载量和疾病严重程度的指标，但大多数EV分离和分析方法在临床应用中不可行。

RT-RPA-CRISPR脂质体的设计、表征和功能评价

该报道描述了一种检测方法的开发，通过抗体与EV表面蛋白CD81的相互作用直接从血浆中捕获EV，然后与含有逆转录酶 (RT)、重组酶聚合酶扩增 (RPA) 试剂的脂质体融合，并使用类似于用于临床诊断的酶联免疫吸附测定（ELISA）的工作流程将CRISPR-Cas12a反应聚集在一起。在该测定中，向导RNA 指导CRISPR-Cas12a与RT-RPA扩增子结合，诱导淬灭寡核苷酸探针的浓度依赖性裂解，用于超灵敏检测SARS-CoV-2 RNA。这种方法采用两种成熟的技术：抗体介导的捕获和脂质体介导的试剂递送，文献中有大量报道描述了临床应用的脂质体合成和稳定方法。

基于CRISPR的RNA检测的机制和工作流程

脂质体-EV融合的表征

该方法直接检测血浆EV中的SARS-CoV-2RNA

参考文献：

NingB, Huang Z, Youngquist BM, Scott JW, Niu A, Bojanowski CM, Zwezdaryk KJ, SabaNS, Fan J, Yin XM, Cao J, Lyon CJ, Li CZ, Roy CJ, Hu TY. Liposome-mediateddetection of SARS-CoV-2 RNA-positive extracellular vesicles in plasma. NatureNanotechnology. 2021 Jul 22. dPMID: 34294909.