AAV病毒包装步骤
(一) AAV-293细胞的冻存
随着传代的次数增加，AAV-293 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止 此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持 续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉细胞培养上清液，加入PBS 洗去残留的培养基；
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大 时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格， 每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000 rpm/min，5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml。
6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏 细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
（二）AAV-293 细胞的传代当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数 量，维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养 基。
（三）AAV-293 细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为37~42℃的水浴。
2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防 止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。
3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混 匀后离心，1000 rpm/min，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6 cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37℃、5% CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情 况。
（四）AAV包装和浓缩
1. 质粒扩增构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提， 浓度大于1ug/ul， A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去 内毒素抽提。
2. 传AAV-293细胞将培养AAV-293 细胞T75 瓶中的培养基吸净，加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37 度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱 离，将其全部晃下，加入3mL 37 度水浴中预热的10％ DMEM，移液枪用10mL 移液 管进行吹打，较大力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培 口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％ DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每 大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n 万/mL 细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转 染，铺900-1000 万/T75；若第三天转染，铺350-400 万/T75。每瓶T75 加10mL 10％ DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培 养基。
3. 做脂转complex
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试剂名称 |
试剂数量 |
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载体质粒 |
5ul(1.0ug/ul) |
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包装质粒 |
5ul(1.0ug/ul) |
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辅助质粒 |
5ul(1.0ug/ul) |
注：LipofiterTM转染试剂，使用说明参考LipofiterTM说明书。