启动子与转录因子互作的研究方法

这是一个关于启动子脱单的故事今天要讲的故事的起点是启动子，终点是找到该启动子上游的转录因子以及如何验证启动子和转录因子之间的结合。当我们确定了某一个基因的启动子之后，后面的实验如何展开常常困扰了许多人！为此，伯小远专门整理了下面的干货，希望可以帮助到大家！有了启动子之后，我们首先要做的就是确定该启动子是否有活性，这个时候就需要我们将启动子克隆出来，然后构建到启动子分析载体上去，根据报告基因的表达情况分析启动子的活性，常见的报告基因有双荧光素酶基因和GUS报告基因。验证了启动子的活性之后，我们就可以用该序列去预测转录因子，当然也可以在验证启动子的活性之前进行预测，因为预测得到的结果对我们来说都只能作为一个参考，具体的转录因子还要具体分析，分析方法一般是根据自己的研究方向和实验目的找已发表的文献来进行确定。对于预测转录因子的网站，伯小远在前面的公众号文章里面已经整理过了（如何预测转录因子？），大家有兴趣可以自己去看哟！很多时候我们研究的可能是一个新基因，关于该基因的报道几乎为零，那么这个时候我们该怎样去寻找启动子上游的转录因子呢？这里伯小远给大家介绍一个方法，希望可以帮助到大家！首先我们可以在网站上预测启动子的顺式作用元件，然后构建启动子的截短体，根据报告基因的表达情况来确定启动子的核心元件，找到启动子的核心元件之后，利用核心元件附近的序列（相比于完整的启动子序列会短很多）再去预测转录因子的网站里面去预测转录因子，这个时候预测得到的转录因子就会少很多！在较少的转录因子里面确定我们想要研究的转录因子就会容易很多！

举个栗子

下面是一篇文献中的用到的截短启动子的研究，从图中可以看出psbPRL-0.7/0截短体的荧光素酶的活性比PsbPRL-1.0/0和psbPRL-0.15/0都要低，表明在-150和-700之间存在一个负调控位点。

图1. sbPRL基因的启动子活性分析（Astola et al., 2003）不管用什么方法，当我们确定了启动子上游的转录因子之后，接下来就需要用实验验证启动子和转录因子之间的结合了。验证启动子与转录因子结合常用的方法包括：染色质免疫共沉淀实验（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）、酵母单杂系统(Yeast one-hybrid system, Y1H)、凝聚阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）以及双荧光素酶作为报告基因的验证实验。

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染色质免疫共沉淀实验

（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）TITTLES1997年Orlando等研发出ChIP（Orlando et al., 1997），主要用于研究转录因子与DNA结合位点的序列信息。然后2009年时，Dominic Schmidt等将ChIP与高通量测序技术结合，发明了ChIP-seq，能够在全基因组范围内检测与蛋白相互作用的DNA区域。ChIP原理将染色质和与之相互作用的转录因子以及组蛋白通过甲醛等物质交联起来，然后通过超声将染色质打碎成小片段，加入针对特定转录因子或特殊修饰的组蛋白抗体，通过Protein A/Protein G微球或磁珠将抗体-转录因子-染色质复合物拖下来，通过PCR或测序的方法检测与目的蛋白相结合的DNA序列，进而研究这些转录因子在细胞发育或者生长中的作用位点。

图2.ChIP原理图ChIP-seq原理将通过ChIP特异性收集到的与目的蛋白结合的DNA片段进行纯化与文库构建，ChIP-seq继承了ChIP的技术难点，需要先用甲醛将与DNA互作的蛋白固定，这个过程会造成一些非相关蛋白交联，形成假阳性。一些作用力小的转录因子或者由于甲醛交联不充分，在超声破碎时会造成假阴性。为了消除背景噪音，则需加大细胞投入量。ChIP以及ChIP-seq无法捕获少量细胞中发生的关键表观基因组学过程。

图3.ChIP-seq 流程

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蛋白质复合物和DNA分子之间的相互作用可以介导必要的基因调节功能，通过染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）技术可以揭示这种相互作用。在这里介绍了一个基于核密度估计方法的强大的统计框架的序列标签的定量富集（QuEST），它利用ChIP-Seq数据可以确定蛋白质复合物结合的DNA的位置。

图4.使用密度剖面表示ChIP-Seq数据。（a）GABP ChIP-Seq序列来自于编码一氧化氮合酶相互作用蛋白基因的启动子和CpG island。GABP在5个细胞中与相应的DNA片段结合的假设示意图，测序读数用蓝色(正向)或红色(反向)标记。（b）从读取数据（上）得到的正向和反向读取密度分布有助于组合密度剖面（下）。（Valouev et al., 2008）ChIP-Seq可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的靶蛋白，是目前研究蛋白质-DNA互作的经典方法。但该技术需要大量细胞，且步骤繁琐，耗时较长，因此，研究者不断在寻找新的替代方法。02

酵母单杂系统

(Yeast one-hybrid system, Y1H)TITTLES实验原理Y1H由酵母双杂交系统发展而来，是一种在酵母细胞内分析与鉴定转录因子和DNA顺式作用元件相互结合的有效方法（Reece-Hoves et al., 2012）。依据此原理构建目的基因与转录激活结构域融合的载体，将顺式作用元件和报告基因分别连在启动子的上游和下游，转录激活域融合蛋白与特异的DNA序列结合激活启动子下游报告基因表达。因此可以通过判断酵母克隆能否在与报告基因对应的营养缺陷型培养基上生长来证明目的蛋白能否与DNA序列结合。由于酵母单杂交系统常常受所用报告基因的影响，较高的假阳性一直是该技术的“瓶颈”问题。此外，在酵母单杂交系统中，假阴性一直被忽略。如某些外源基因的蛋白表达产物可能对酵母本身有毒性作用，影响酵母细胞的生长和表型，而这其中可能就包含着与靶DNA序列相互作用的蛋白。

图5.酵母单杂原理图

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Bsr-d1编码一个类似C2H2的转录因子，由于EP1S序列包含核心的C2H2结合位点（Yoshioka et al., 2001），为了确定BSR-D1蛋白是否为C2H2型DNA结合蛋白，作者在酵母单杂交实验中检测了它是否与EP1S序列结合。结果显示，当与GAL4激活域(AD)融合时，BSR-D1与EP1S序列结合并激活HIS2报告基因（图6）。

图6. 在酵母单杂化中与EP1S结合。将包含EP1S融合到pHIS2报告基因的表达载体和编码Bsr-d1融合到GAL4 AD的表达载体上共转化至酵母细胞中。（Li et al., 2017）03

凝聚阻滞实验

（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）TITTLESEMSA称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测，是一种用于研究转录因子和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的DNA结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。

图7.EMSA原理图

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在一篇文献中，为了确认MYBS1转录因子与Bsr-d1启动子的结合以及在启动子中的结合位置，作者进行了EMSA实验。作者首先在大肠杆菌中表达并纯化了融合谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的MYBS1蛋白。对于探针，作者合成了生物素标记的寡核苷酸，分别为两个假定的MYB结合位点MYS1和MYS2，它们存在于Bsr-d1启动子区域（图8A）。EMSA结果显示，GST-MYBS1与MYS1结合，而与MYS2没有结合，并且GST-MYBS1与Digu MYS1的亲和力高于LTH MYS1。单独的GST不能结合到MYS1探针上（图8B，左）。为了确认Digu MYS1具有更高的结合亲和力，作者重复了三次实验，定量的结果（图8B，右）验证了上述观察的结果。接着结合的特异性通过竞争结合的实验进一步得到证实，野生型竞争对手大大减少了与探针的结合，而突变的竞争对手几乎没有影响（图8C）。这些结果表明，MYBS1蛋白在Bsr-d1启动子中结合了MYBS1，并且与Digu MYS1的亲和力比LTH MYS1高的多。

图8. MYBS1与Bsr-d1启动子的直接结合。（A）Bsr-d1启动子中的两个假定的MYB结合位点；（B）EMSA分析；（C）MYBS1与MYS1的结合特异性。（Li et al., 2017）04

双荧光素酶作为报告基因验证

启动子与转录因子的结合TITTLES转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。双荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。实验原理构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒。然后，将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293T细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。最后，加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

图9.双荧光素酶报告基因验证转录因子与启动子结合原理图

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如下图10A所示，AP-2、Sp1、ETS1这些转录因子在600bp启动子的基础上产生一系列假定结合位点的点突变或缺失。在三个黑色素瘤细胞株中，利用这些转录因子突变或野生型的pCTPCEACAM1载体与SOX9或空载体共转染。在所有三个黑色素瘤细胞株中，SOX9对启动子的抑制作用在带有突变Sp1结合位点的载体中显著受阻（图10B）。在带有突变的ETS1结合位点的载体中也观察到类似的，但更温和的受阻效应（图10C）。AP-2结合位点的缺失对三个黑色素瘤细胞株中的两个有较小的影响（图10D）。这些综合结果表明，SOX9主要通过Sp1和部分通过ETS1来调节其对CEACAM1启动子的抑制作用。

图10. 转录因子Sp1、ETS1和AP-2介导CEACAM1启动子的SOX9下调。（A）转录因子假定的结合位点的突变构建方案；(B) 对Sp1假定结合位点突变的实验；（C）四个ETS1假定结合位点突变的实验；（D）删除AP-2假定的结合位点的实验。（Ashkenazi et al.,2016）好了，到这里伯小远已经介绍完了如何从一个启动子开始，确定其上游的转录因子，然后可以通过哪些实验验证启动子与转录因子的结合，当然也有其它一些方法可以验证启动子与转录因子的结合，这里就不介绍那么多了，大家有兴趣可以自己去查阅文献。下面对本期的公众号文章做一个简单的总结，希望大家看完之后有所收获，做这类实验最关键的一步还是确定启动子上游的转录因子，实验方法其实都是比较成熟的东西，想用哪种方法直接做就可以了！

小 结

参考文献：

[1]Ashkenazi, S., Ortenberg, R., Besser, M., Schachter, J., & Markel, G. (2016). Sox9 indirectly regulates ceacam1 expression and immune resistance in melanoma cells. Oncotarget,7(21), 30166-30177.

[2] Li, W., Zhu, Z., Chern, M., Yin, J., Yang, C., & Ran, L., et al. (2017). A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell,170(1), 114-126.

[3] Orlando, V., Strutt, H., & Paro, R. (1997). Analysis of chromatin structure byin Vivo Formaldehyde cross-linking. Methods, 11(2), 205-214.

[4] Reece-Hoyes, J.S. and Marian Walhout, A.J. (2012) Yeast One-Hybrid Assays: A Historical and Technical Perspective. Methods, 57, 441-447.

[5] Valouev, A., Johnson, D. S., Sundquist, A., Medina, C., Anton, E., & Batzoglou, S., et al. (2008). Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on chip-seq data. Nature Methods,5(9), 829.

[6] Yoshioka, K., Fukushima, S., Yamazaki, T., Yoshida, M., and Takatsuji, H.(2001). The plant zinc finger protein ZPT2-2 has a unique mode of DNA interaction. J. Biol. Chem. 276, 35802–35807.向上滑动查看更多内容