cccDNA替代小鼠模型构建技术原理

HBV感染的人肝脏细胞中含有3.2 kb松弛环状rcDNA，在细胞核中，rcDNA修复为cccDNA是病毒转录复制的起始模板。cccDNA转录的病毒前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在细胞质内包装入核衣壳，通过反转录起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣壳颗粒再次转运至细胞核，完成细胞内的病毒复制周期。HBV基因组高度压缩，难以容纳外源性序列^[37]。已经开发了多种途径，通过体外重组生产cccDNA(rcccDNA)^[38]，rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生，是HBV研究的一类重要工具。

2014年Qi等^[39]开发了一种基于HDI的重组cccDNA小鼠模型，通过Cre/loxP介导的DNA重组在体内生成cccDNA。在HBV基因组两侧引入同向LoxP位点，由重组酶Cre引发LoxP位点之间的DNA重组和环化，生成含有单拷贝LoxP位点的rcccDNA；LoxP位点则位于一段约90 bp的外源性内含子中(HBsAg基因近5′端)，可在RNA转录过程中移除，实现所谓的无缝插入。然而，该模型中病毒复制水平较低，体内持续时间较短，可能是由于转染细胞中Cre依赖性重组酶激活了免疫系统。另外两个含DNA的细菌质粒共转染，重组效率低，导致cccDNA转染肝细胞非常低。传统的含有DNA的细菌质粒，导致体内转基因的快速转录沉默，即使载体DNA仍然保留在细胞中。Kay等^[40]开发了一种PhiC31整合酶介导的分子内重组技术，以制备无细菌主链的微型环载体DNA，可在体外和体内表达高水平的转基因。基于大肠杆菌PhiC31重组酶诱导表达系统，建立了一种体外诱导rcccDNA attR微环产生和纯化的策略，纯化的rcccDNA attR微环具超螺旋结构，能够支持功能性的HBV复制和抗原表达。由于rcccDNA编码中包含外源内含子序列，应用引物特异性PCR方法易于与HBV DNA复制中间体及从头合成的新生cccDNA区分。最近，在采用复制缺陷腺病毒载体将rcccDNA转入肝脏特异的Cre小鼠中检测到HBV的时间超过62周^[41]。在小鼠肝脏中，观察到了持续坏死性炎症反应、纤维化和肝硬化等病理学特征，与临床慢性肝炎相似。Yan等^[42]发表的文章中，将39 bp的attR位点设计插入在HBV多聚酶基因的spacer区(PreS1起始密码子前)，显示并不影响病毒复制。通过免疫正常的小鼠尾静脉HDI注射rcccDNA，可短期诱导HBV抗原血症(平均5~7周)，与急性HBV感染相似。他们比较了C3H/HeN、FVB/N和CBA/J三种小鼠，其中C3H/HeN小鼠感染率最高，半数以上小鼠体内HBV复制持续1年以上。cccDNA替代模型可用于研究慢性病的免疫反应和发病机制，这也有助于评估cccDNA靶向抗病毒药物策略。然而，由于这类模型仍是小鼠的肝脏细胞，不涉及HBV的入侵、扩散和再传染的过程，仍不能替代人鼠嵌合肝脏人源化小鼠模型。