科研 | Nature Cancer：TNF阻断可通过靶向肠道炎症改变微生物群进而降低结直肠癌的发生
编译：mallow，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道炎症和微生物群是结直肠癌（CRC）病因的两个重要组成部分。但是，尚不清楚使用临床上相关的抗炎治疗调节炎症是如何影响微生物群的，或者这是否会影响CRC的结果。
作者使用产生粘菌素的大肠杆菌定殖的化学诱导（DSS/Apcmin/+）和自发（Apcmin/+;Il10-/-）CRC小鼠模型，确定微生物群在介导抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的抗肿瘤发生作用中的效果。
作者发现，TNF阻断可减轻结肠炎和CRC的发展。微生物群落结构和基因活性随着疾病的发展而发生显著变化，TNF阻断能阻止肠道微生物的改变。抗TNF治疗后，患者的几种微生物群落功能途径也发生了类似的变化。但在同笼饲养条件下，TNF阻断未能阻止结肠炎、癌症发展和疾病相关的微生物群结构变化。微生物群移植显示来自抗TNF处理小鼠的微生物群致癌活性降低。因此，作者证明了微生物群的可塑性，并可通过靶向炎症将其恢复到非致癌状态。
论文ID
原名：Amending microbiota by targeting intestinal inflammation with TNF blockade attenuates development of colorectal cancer
译名：TNF阻断可通过靶向肠道炎症改变微生物群进而降低结直肠癌的发生
期刊：Nature Cancer
时间：2020.06
通讯作者：Christian Jobin
通讯作者单位：美国佛罗里达大学医学院
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实验设计
1. NC101，NC101同基因突变体ΔclbP或共生菌株K12（对照）定植SPF Apcmin/+小鼠，并用葡聚糖硫酸钠（DSS）处理小鼠诱导结肠肿瘤发生，以确定在复杂菌群存在下粘菌素对NC101致癌活性的贡献；
2. 无菌Apcmin/+;Il10-/-小鼠转移到SPF环境中，并用接种3种大肠杆菌菌株；
3. 在炎症诱导后用PBS（对照）或TNF中和抗体处理NC101定植的Apcmin/+小鼠，验证抗炎治疗（例如TNF阻断剂）是否可以在小鼠模型中阻止CRC发展；
4. 共同饲养接受PBS或TNF中和抗体的DSS/Apcmin/+小鼠，确定微生物群对通过TNF阻断预防CRC的影响；
5.来自单独饲养的PBS或抗TNF处理的小鼠盲肠内容物分别接种无菌Apcmin/+小鼠进行微生物群移植，然后用DSS诱导CRC，以确定治疗引起的微生物群改变是否足以影响CRC的发展。
实验结果
1 产粘菌素（clb+）大肠杆菌通过带有复杂微生物群的小鼠中的粘菌素活性促进CRC发展
clb+大肠杆菌着色剂NC101被证明可通过粘菌素活性促进CRC的发展。clb基因组岛缺失减弱了NC101驱动的在无特定病原体（SPF）环境中的氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）小鼠模型中的CRC。除粘菌素合成外，clb基因还参与细菌功能，如clbA有助于铁载体生产和铁吸收。为了确定在复杂菌群存在下粘菌素对NC101致癌活性的贡献，用NC101，NC101同基因突变体ΔclbP或共生菌株K12（对照）定植SPF Apcmin/+小鼠，并用DSS处理小鼠诱导结肠肿瘤发生（图1a）。临时低剂量DSS治疗可导致Apcmin/+小鼠发生类似的炎症。NC101定植小鼠比K12和ΔclbP定植小鼠出现更多的结肠肿瘤，但后两组之间没有观察到差异（图1b，c）。在定植不同大肠杆菌菌株的小鼠中，肿瘤大小、粪肠杆菌载量和大肠杆菌相对丰度是相似的（图1d–f）。
作为独立模型，作者将无菌Apcmin/+;Il10-/-小鼠转移到SPF环境中，并用接种3种大肠杆菌菌株（图1g）。Apcmin/+;Il10-/-小鼠发展为微生物依赖性加重性结肠炎和CRC。与DSS/Apcmin/+模型相似，NC101定植的Apcmin/+;Il10-/-小鼠比K12或ΔclbP定植小鼠明显出现更多的结肠肿瘤（图1h，i）。远端结肠组织学评分（图1j，k）和关键炎症细胞因子mRNA结果显示，在被不同大肠杆菌菌株定殖的Apcmin/+;Il10-/-小鼠中肠炎症是相似的。在定植于不同大肠杆菌菌株的Apcmin/+;Il10-/-小鼠之间，粪肠杆菌载量无显著差异（图1l），大肠杆菌的相对丰度不受粘菌素产生的影响（图1m）。化学诱导和自发的两种小鼠模型结果表明，粘菌素的产生促进了具有复杂微生物群的小鼠的CRC发生，特别是肿瘤的发生，而不会影响大肠杆菌的致结肠炎活性或腔内定植。此外，SPF小鼠中的肠杆菌（图1e，l）和大肠杆菌水平非常低。
2 TNF阻断减轻结肠炎和CRC的发展
鉴于炎症对于clb+大肠杆菌诱导的癌变是必不可少的，作者认为抗炎治疗（例如TNF阻断剂）可以在小鼠模型中阻止CRC发展。为了验证该假设，作者在炎症诱导后用PBS（对照）或TNF中和抗体处理NC101定植的Apcmin/+小鼠。在第14天（注射四次抗体后），与PBS处理的对照相比，抗TNF处理的小鼠结肠炎组织学评分较低，证实了TNF阻断剂的抗炎作用。如γH2AX免疫组化结果所示，抗TNF治疗与再生结肠隐窝中DNA损伤的发生率降低相关，表明TNF阻断可防止DNA损伤。在第35天，尽管两个治疗组之间的肿瘤大小相当，但抗TNF处理小鼠的结肠肿瘤明显少于PBS处理小鼠（图2a-d）。这种作用不是由NC101定植受损导致的，因为TNF阻断并未显著影响粪便肠杆菌载量，粪便NC101相对丰度或随疾病发展的组织相关NC101水平（图2e-g）。
接下来作者检查了TNF阻断对NC101定植的Apcmin/+;Il10-/-小鼠的影响。与对照相比，抗TNF治疗的Apcmin/+;Il10-/-小鼠的结肠肿瘤明显减少，结肠炎症评分较低（图2h-k）。这些反应与抗TNF治疗小鼠远端结肠中较低水平的Il1b和Ifng以及较高水平的Il18有关，与这些细胞因子在CRC发病机理中的不同作用一致。在Apcmin/+;Il10-/-模型中，TNF阻断降低了结肠隐窝DNA损伤反应的发生率，而没有显著影响粪便或与组织相关的肠杆菌和NC101的水平（图2l-n）。两个模型的数据表明，针对炎症的抗TNF治疗可预防CRC的发展。
3 TNF阻断改变微生物群的组成和活性
据报道，抗TNF疗法可诱导炎症性肠病（IBD）患者微生物组成的改变。为了在临床前模型中确定与疾病发展和抗TNF治疗相关的微生物群落结构变化，作者对纵向粪便样本和远端结肠进行16S rRNA基因测序。在DSS/Apcmin/+模型中，粪便纵向微生物分布图显示，在对照和抗TNF处理的小鼠中微生物群α和β多样性均存在明显的时间相关变化。表明微生物群随着CRC的发展而动态演化。从第0天到第35天，韦荣球菌和毛螺菌科的两个属的相对丰度在对照组中增加，但未在抗TNF治疗的小鼠中出现，表明它们与肿瘤发生有关。各治疗组之间粪便和结肠组织相关菌群的β多样性（而不是α多样性）有显著差异（图3）。与对照组相比，抗TNF处理小鼠终点粪便中韦荣球菌的丰度显著降低。纵向或在对照和抗TNF处理的小鼠之间没有观察到肠杆菌相对丰度的显著变化。在Apcmin/+;Il10-/-模型中，粪便微生物群组成随时间而显著变化，并且在对照和抗TNF处理的小鼠之间，端点粪便和结肠组织中的微生物群β多样性（而不是α多样性）显著不同。在各治疗组之间仅梭菌科02d06属在抗TNF治疗小鼠的终点粪便中显著升高。尽管未受到TNF阻断的显著影响，但终点粪便韦荣球菌的丰度与Apcmin/+;Il10-/-鼠中的肿瘤数量呈正相关。在两种小鼠模型中，TNF阻断对微生物群组成的影响是可重现的。
接下来作者通过对从PBS和抗TNF处理的DSS/Apcmin/+小鼠收集的第14天和35天粪便进行RNA-seq来评估微生物群活性。各时间点以及治疗组之间的微生物基因活性均存在显著差异（图4a，b）。KEGG分析显示对照小鼠CRC发展过程中微生物卟啉和叶绿素代谢下降（图4c）。在第14天与对照小鼠相比，该途径与其他九种途径（如氨酰基-tRNA生物合成，细胞周期柄杆菌，氨基酸生物合成，抗生素生物合成和核糖体）在抗TNF处理小鼠中显著下调（图4d）。在第14天，抗TNF处理小鼠中只有两条途径（芳香族化合物和苯丙氨酸代谢）显著上调（图4d）。在第35天，细胞周期柄杆菌，氨酰基-tRNA的生物合成，氨基酸生物合成和核糖体在抗TNF处理的小鼠中保持较低的活性，同时还抑制了三种其他途径，包括氨基糖和核苷酸糖代谢，过氧化物酶体以及苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸生物合成（图4e）。
为了了解人类微生物群活性是否发生类似变化，作者在数据库中比较了抗TNF治疗前后IBD患者的纵向粪便转录组。发现治疗前有5条KEGG通路明显升高，治疗后有4条KEGG通路明显升高。小鼠模型中受TNF阻断影响的几种途径在接受抗TNF治疗的IBD患者中有着相似的变化（图4d，e）。
至于差异表达的基因，在第14天PBS和抗TNF处理的小鼠之间发现最大数量，而在第14天到第35天之间PBS处理的小鼠中观察到最小数量。这表明治疗（尤其是在早期肿瘤发生期间）对微生物基因活性的影响比时间更强。由于参考小鼠肠道基因组数据库不包含clb基因，因此作者将RNA-seq读数与NC101 clb基因序列进行比对，以评估clb岛活性。数据表明NC101的丰度不会随时间或治疗而改变。尽管在PBS和抗TNF处理小鼠之间未观察到单个clb基因表达的显著差异，但在14天和35天PBS处理小鼠的clb岛表达明显高于抗TNF治疗的小鼠。表明在早期肿瘤发生过程中，对照小鼠NC101 clb活性增加，炎症更高，并且在整个肿瘤进展过程中一直保持这种状态。
4 微生物群介导TNF阻断的CRC预防作用
为了确定微生物群对通过TNF阻断预防CRC的影响，共同饲养了接受PBS或TNF中和抗体的DSS/Apcmin/+小鼠（图5a）。纵向粪便样品和远端结肠组织的16S rRNA基因测序显示，共同饲养的PBS和抗TNF处理的小鼠具有相似的微生物群结构，表明微生物群已成功标准化（图5b）。粪便NC101丰度在共同饲养的对照和抗TNF处理小鼠之间相似（图5c）。在共同饲养的抗TNF处理小鼠中发生明显丰度变化和沿着疾病发展方向变化的细菌类群与PBS处理的小鼠相似。表明在寄居条件下TNF中和对微生物组成无效，PBS处理的小鼠中微生物群在共同饲养的抗TNF处理小鼠群落形成方面起着主导作用。在共同饲养条件下，TNF阻断不能减弱结肠炎症（图5d）或结肠直肠癌的发生（图5e-g）。在Apcmin/+;Il10-/-小鼠模型中，共同饲养消除了TNF阻断对炎症和肿瘤发生的保护作用。这些数据表明，TNF阻断的CRC预防作用取决于微生物群向非疾病状态的转变，这一过程可以通过持续暴露于与疾病相关的微生物群而被覆盖。
为了确定治疗引起的微生物群改变是否足以影响CRC的发展，作者通过来自单独饲养的PBS或抗TNF处理的小鼠盲肠内容物分别接种无菌Apcmin/+小鼠进行微生物群移植，然后用DSS诱导CRC（图6a）。微生物群分析结果显示，PBS和抗TNF相关样品之间清晰分离（图6b）。与抗TNF处理的微生物供体相比，PBS处理的微生物供体具有明显更高的韦荣球菌丰度和更低的梭菌丰度。在PBS和抗TNF微生物群受体之间未观察到NC101相对丰度的差异（图6c）。尽管肿瘤大小相当，但PBS微生物群受体比抗TNF微生物群受体肿瘤多（图6d–f）。因此，TNF阻断改变微生物群在功能上会减弱CRC的发展。
图5 同笼饲养取消TNF阻断对微生物群，炎症和CRC的作用
图6 TNF阻断相关的微生物群显示降低的致癌活性
结论
本研究利用目前最有效的治疗炎症性肠炎的手段—TNF抗体和阻断剂在两种小鼠CRC模型上测试了TNF抗体对肠道炎症，细菌群落组成和功能，以及癌症发展的影响。
作者发现在两种模型里，TNF抗体都减缓了炎症和癌变发生。通过测序分析，作者发现这同时伴随着肠道细菌群落组成和功能的变化，而且有相当一部分的变化与接受TNF抗体或阻断剂治疗的炎症性肠炎病人一致。为了揭示这种治疗引起的肠道菌落变化对疾病的影响，作者使用了两种方法。一方面，作者将接受和未接受TNF抗体治疗的小鼠同笼饲养。由于小鼠会食用同伴的粪便，同笼饲养使得接受和未接受治疗的小鼠肠道菌落保持一致。这种情况下作者发现TNF抗体不再具有抑制炎症和癌变的效果，同时也丧失了调节肠道菌落的功能。另一方面，作者用粪便微生物移植的方式将分开饲养的接受和未接受TNF抗体治疗的小鼠的肠道菌落转移到无菌小鼠体内。这种情况下，带有接受TNF抗体治疗的小鼠的肠道菌落的小鼠，与带有未接受TNF抗体治疗的小鼠的肠道菌落的小鼠相比，肠道炎症和癌变都明显地减弱。这一系列的实验说明消除炎症的治疗方式在很大程度上是通过调节肠道菌落功能来抑制肠道癌变，而成功地调节肠道菌落又在很大程度上受到从环境中摄入的细菌的影响。
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