科研 | npj Biofilms and Microbiomes：生酮饮食会影响严重癫痫患儿肠道菌群的分类和功能组成
编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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人类肠道菌群在健康和疾病中的作用越来越受到人们的关注，营养不良（肠道微生物组的紊乱）已通过“微生物组-肠-脑轴”与自闭症、焦虑症和抑郁症等神经症状相关联，且此轴是肠道微生物组和中央微生物之间的双向通讯系统。饮食会影响人体肠道微生物组的组成，高脂肪而低碳水化合物的饮食会引起中间代谢的多种变化，并导致使用酮作为主要能源底物，而生酮饮食（KD）用于治疗癫痫和神经代谢异常，葡萄糖不能完全用作底物。虽然KD临床使用历史悠久，但移植癫痫发作的作用机制尚不清楚，因此，研究工作者检查了癫痫患儿粪便微生物组如何受到KD影响。
本研究从医院纳入2-17岁的患儿12名，其中11名患有抗药性癫痫病，1名患有神经代谢疾病以及丙酮酸脱氢酶缺乏症，且男性为4位，女性为8位，饮食开始的平均年龄为7.7±4.5岁，癫痫发作的平均年龄为2.1±2.1岁。在开始KD时，孩子们每天都接受AED治疗，期间进行疗效随访和第二次粪便微生物取样，且保证所有患者与饮食开始前相同的AED和剂量。孩子的父母充当对照，且对照组的饮食摄入正常-西餐，没有任何特定的饮食，在研究期间饮食也无特定的变化。在KD之前一个月和KD期间记录癫痫发作的次数和类型，用于定义癫痫发作反应。KD开始之前早餐前的第一个早晨采集静脉血样本，用于分析葡萄糖和酮β-羟基丁酸，并收集粪便样本。
本文研究表明饮食中的α多样性没有显著变化，但是在分类学和功能组成上均存在差异。在干预过程中，双歧杆菌、大肠埃希氏菌和迪亚斯特菌的相对丰度明显降低。在KD上观察到大肠杆菌的相对丰度增加。功能分析揭示了29个SEED子系统的变化，包括减少了涉及碳水化合物代谢的七个途径。这些转变的分解表明双歧杆菌和大肠埃希菌是观察到的功能转变的重要贡献者。随着KD期间相对丰富的促进健康，消耗纤维的细菌数量减少，本研究的结果引起人们对饮食以及肠道菌群和整体健康的影响的关注以及进一步的研究需要调查这些改变对于KD的治疗效果是否必要的重要性。
论文ID
原名：The ketogenic diet influences taxonomic and functional composition of the gut microbiota inchildren with severe epilepsy
译名：生酮饮食会影响严重癫痫患儿肠道菌群的分类和功能组成
期刊：npj Biofilms and Microbiomes
IF：6.333
发表时间：2019.1.23
通讯作者：Stefanie Prast-Nielsen
作者单位：微生物学、肿瘤与细胞生物学系转化微生物学研究中心（CTMR）
实验设计
结果
1 测序结果和评估
患者的平均测序深度为2.24±0.59（平均值±标准差）百万，健康父母为2.05±0.75（平均值±标准差）百万。原始读取长度为2×300 bp。
对照组的处理和测序与所有样品相同。它用于测试基于标记的方法、基于比对的方法（RTG）和基于kmer的方法进行分类方法分析。本研究的测序数据最好使用基于标记的分类谱来重新捕获，然后用于进一步分析。本研究还证明了样品制备工作流程可确保从包括革兰氏阳性和革兰氏阴性生物在内的不同细菌类群中高效裂解和提取DNA。但是，使用任何经过测试的生物信息学工具都无法识别出对照组的真菌。
2 肠道微生物多样性
Beta多样性测量反映了样品之间的成分差异。肠道菌群分类学组成的主成分分析（PCA）显示，对照样品的聚类和患者样品的一些聚类，但患者样本之间的差异总体上大于对照组样本（图2a）。与对照组相比，在时间点1处检测到沿x轴的偏移，在时间点2处检测到沿y轴的偏移。这表明患者的肠道菌群与对照组不同，KD的引入对肠道菌群的组成有影响。如图2a所示，在SEED子系统3级中，肠道菌群功能成分的PCA（图2b）再现了对照的群集，而患者的群集较少。在第一个时间点，与对照相比，患者样品沿x和y轴移动，在第二个时间点，这种移动更加明显，表明患者和对照之间肠道菌群的功能谱存在差异，并且KD影响了功能组成。
图1 微生物alpha多样性分析
图2 微生物beta多样性分析
3 KD时期肠道菌群分类学变化分析
在第一时间点，来自患者和对照的粪便样本中KD优势门的肠道菌群的分类学变化分析是硬毛菌、拟杆菌属和放线菌（图2c），两组均检测到。在对照组中放线菌的相对丰度在几个个体中已经降低。与患者相比，放线菌属和硬菌属的相对丰度降低，而拟杆菌属和变形杆菌的相对丰度均升高。
随后，在各种分类学水平上检测到19个判别特征（图3a）。在门静脉水平上，开始KD后3个月，放线菌的相对丰度显着降低，而变形杆菌则按比例增加。放线菌属相对丰度的降低主要归因于双歧杆菌属的相对丰度的降低（图3b），KD之前的平均相对丰度为15.8％。进入KD的3个月：3.9％。在双歧杆菌属中，有两个物种显着减少：长双歧杆菌（KD前平均相对丰度：8.1％； KD后3个月：2.4％）和青春芽孢杆菌（KD之前：3.2％； KD之前3个月：0.2％）。在KD期间，真细菌和小杆菌属的平均相对丰度也降低了（分别为2.5％； 0.5％； 2.2％； 0.4％）。大肠埃希菌属在开始KD后3个月相对相对丰富（平均：之前为3.1％；之后为8.5％），这主要是由于大肠杆菌的增加。将相同的参数应用于父母数据集，从时间点1到时间点2，一株未分类的古杆菌（Eubacteriumsiraeum）的相对丰度显着增加。此处未发现发现患者明显改变的特征。
图3 分类概况的统计分析
4 KD期间肠道菌群的功能变化分析
在KD上使用3个月后，26种途径的相对丰度降低，而3种变得相对丰富。途径变化最大的组是碳水化合物代谢，显示出低聚果糖（FOS）和棉子糖利用，蔗糖利用，糖原代谢，乳酸-N-二糖I和半乳糖-N-二糖代谢途径减少。发酵：乳酸，戊糖磷酸途径；与甲醛同化：核糖-磷酸途径。父母数据集的分析在p <0.01或p <0.05和LDA> 2.0时均未检测到任何歧视性特征。
潜在的分类学贡献观察到的功能变化预测表明，双歧杆菌相对丰度的降低和大肠埃希氏菌相对丰度的提高均导致多种途径（包括碳水化合物代谢途径）的相对丰度降低（图4a）。相反，预计途径相对丰度的增加是属特异性更高的。例如，推断埃希氏菌和拟杆菌的相对丰度增加是Hemin转运系统途径增加的潜在驱动力。另外，这种分解还推断出埃格氏菌相对丰度的增加可能会推动琥珀酸脱氢酶子系统的增加（图4b）。
图4 与KD相关的功能转移的分类学驱动因素
5 丁酸生产潜力的分析
直肠念珠菌是人肠道中主要的丁酸盐生产物种，在KD期间患者的比例显着下降。为了分析这是否会影响整个群落总丁酸的合成潜力，对于已知的微生物丁酸生产途径bcd / etfAB上游（丁酰辅酶A脱氢酶）的所有基因的RPKM值进行了计算。由于募集了许多假阳性，因此排除了谷氨酸途径的gcdB。KD干预对这些途径中任何一种的相对丰度没有任何总体上的显着影响（图5a，b）。但是，与开始KD之前的对照组相比，健康人肠道微生物组中最丰富的丁酸生成途径（即乙酰辅酶A途径）中的基因缺乏。在患者的年龄与相对基因丰度之间检测到非常弱但呈负相关的关系，这表明与KD之前的对照组相比，患者中乙酰辅酶A途径的基因相对丰度较低（图5c）。相反，患者年龄的增加可能会增加与对照组的差异。对于4-氨基丁酸酯途径显示出相反的趋势（图5d）。与乙酰辅酶A途径相比，该途径在健康肠道微生物组中相对较少。与KD之前的对照相比，该途径的基因在患者中的识别频率更高，但不显着，KD期间经历了进一步的成比例增加。相对基因丰度似乎随着患者年龄的增加而略有增加，这表明该观察结果也不能用患者和对照组的年龄差异来解释。赖氨酸途径在任一时间点的组内或组间相对基因丰度均未显示任何显着差异。在谷氨酸途径中，患者的六个基因之一的相对丰度显着降低。但是，并没有降低与此途径相关的伴随酶亚基hgCoAdB和hgCoAdC或其他基因的相对丰度。因此，在任何一组样品中，谷氨酸途径的相对丰度不存在显著差异。
图5 丁酸盐生产潜力分析
讨论
自1920年代以来，KD已成功用作抗治疗性癫痫的替代疗法。大约一半的患者对此饮食反应减少了一半的癫痫发作。另外，也有许多研究试图阐明KD的作用机制。最近，在动物模型中已有微生物组参与癫痫发作易感性和KD治疗的证据。KD在两种癫痫小鼠模型中均显示出抗癫痫药的功效，但在小鼠无菌饲养时却没有。粪便微生物移植（FMT）可以转移大鼠的癫痫药敏感性，这一结果得到了单例研究的证明，FMT治疗克罗恩病后至少20个月无癫痫发作。
此外，本研究验证了接受KD治疗的癫痫患者粪便微生物组的分类和功能变化。十二个孩子遵循严格的KD比例为3：1至4：1。在开始KD之前和之后3个月，从患者中收集粪便样本。在相同的时间点对11名健康的父母进行了采样，但没有开始使用KD作为对照。整个宏基因组测序揭示了由于KD导致的分类学和功能变化。接受KD治疗3个月后，双歧杆菌属的相对丰度明显降低。长双歧杆菌和青春双歧杆菌的物种显着减少，但其他双歧杆菌（如双歧双歧杆菌和链状双歧杆菌）也观察到类似趋势（数据未显示）。
双歧杆菌对健康的人胃肠道很常见。它们代谢复杂的碳水化合物，并拥有最大的预测糖酵素组之一，包括编码称为六糖磷酸分流或“双歧”分流的特定己糖发酵途径的基因。该途径在产生的能量输出方面优于其他发酵所用的途径肠道细菌，并在复杂碳水化合物存在下为双歧杆菌提供了生长优势。这充分证明在KD期间双歧杆菌和参与碳水化合物代谢的基因的比例减少。
Duncan等与本研究在低碳水化合物饮食中双歧杆菌和直肠大肠杆菌相对丰度降低的发现一致，以及假设，即这可能导致乙酸和乳酸的产生降低。乙酸盐和乳酸盐是双歧管的产物。两种酸都会导致肠道pH降低，这可能会阻止病原体生长。另外，研究表明双歧杆菌可以通过产生乙酸盐来保护小鼠免受肠致病性大肠杆菌O157：H7的感染。在本研究中，双歧杆菌的相对丰度在KD期间降低，而大肠杆菌的相对丰度增加。这可能是由于双歧杆菌产生的乙酸盐减少或腔内pH增加。阿格斯等的研究表明，富含高脂肪和高糖的西方饮食会增加小鼠肠道中细菌的相对蛋白含量，从而增加肠道细菌的相对蛋白含量，并增加其对黏附性大肠杆菌感染的敏感性。大肠杆菌是一种由共生和致病菌组成的多用途物种，并且可以通过交叉摄食多种来源中的碳水化合物，包括膳食纤维，还有脱落的上皮细胞，以及通过肠厌氧菌降解的粘膜多糖。大肠杆菌与多种慢性肠道疾病有关，包括炎性肠病（IBD）。因此，KD期间大肠杆菌的扩增可能与本研究患者的整体肠道健康有关。
产生丁酸盐的肠道细菌可以消耗乙酸盐。Riviére等人也证明了长双歧杆菌和直肠双歧杆菌之间相互交叉喂食。这可能会导致本研究的数据集中大肠杆菌相对丰度的下降，减少某些碳水化合物（抗性淀粉或麦麸）的消耗量也可能直接影响到了按比例减少大肠杆菌。双歧杆菌和直肠埃希氏菌耗竭的结果可能是短链脂肪酸（SCFA）的产量降低，特别是双歧管中的乙酸盐和直肠埃希氏菌的丁酸酯含量降低。SCFA对整体健康很重要，低粪便含量与IBD35和晚期结直肠腺瘤等疾病有关，乙酸盐和丁酸盐都显示出抗炎活性。此外，丁酸盐还可以直接抑制炎症。肠道健康是结肠细胞必不可少的能量来源，并能增强肠道屏障功能。在本研究的数据集中，开始饮食前患者的直肠大肠杆菌相对丰度较低，但在KD期间进一步降低。但是，产生丁酸盐的菌落是一个分类学上不同的功能群体。
根据本研究的结果，假设在开始KD之前，癫痫患者的丁酸酯生产状况可能与对照组相比有所不同，从4-氨基丁酸酯途径挽救的丁酸酯相对较多，而从乙酰辅酶A途径挽救的丁酸酯相对较少。在KD期间可能会增加这种差异。从数据集中无法得出癫痫患者总体丁酸生成量是否较低的结论。测量实际代谢产物丁酸酯的更大的数据将提供对这一发现的更多见解。
其他研究最近还通过实时qPCR选定的微生物分类群或16S rRNA基因测序进行了KD治疗GLUT1缺乏症候群或癫痫儿童的纯粹分类学变化，结果不一致。而Tagliabue等检测到脱硫弧菌属的显着增加。在意大利人群中进行KD期间，他们的结论与本研究的结论一致-有关KD对肠道健康的有害影响的担忧。他们确定了可能需要补充益生菌或益生元的建议。另外，在最近的一项研究中，益生菌治疗可使28.9％的癫痫患者的癫痫发作次数减少50％以上。与Zhang等人的观点一致，由于下列原因导致的放线杆菌的α多样性和相对丰度降低KD，但他们并未发现中国数据中的大肠杆菌呈比例增加。
在本研究中，有5名患者（41.7％）的癫痫发作次数减少了多于50％。但是，在10名儿童（占83.3％）中，认知和运动功能得到了改善。有趣的是，Ma等在小鼠中发现KD增强了包括脑血流在内的神经血管功能，这可能会影响认知能力。到目前为止，尚不清楚在人类中是否可以观察到。
本研究的一项优势是研究KD期间肠道菌群的分类学和功能变化。但是，此研究本身存在某些弱点。由于该试验队列的规模较小（12名患者和11名对照），本研究正在继续招募患者进行更大的研究，目的是对无反应者进行分类，以识别其肠道菌群的差异。另一个弱点是该癫痫队列的异质性，其中包括了不同的病因，尽管有包括遗传学在内的深入研究，三分之一的患者仍无法获得特定的病因。该研究也缺乏与年龄匹配的对照。健康儿童的入学证明很困难，但是患者的父母（同一个家庭）同意参加。即使没有父母为自己开始KD，他们也可能在一定程度上改变了饮食习惯，即少吃糖和多脂肪。这可能解释了放线菌相对丰度的下降（图2c）的原因，但是在统计学上并不显着。除此之外，与第一和第二时间点相比，父母的微生物组更加稳定，父母中患者的KD均未发现因KD而显着改变的分类单元或途径。重要的是，由于本文旨在研究KD对肠道菌群的影响，因此比较了患者组中开始KD之前和之后3个月之间的群落和功能。
评论
评论
本研究通过KD饮食深入的验证了其在减少癫痫发作中的功效以及其具体的作用机制，生动的说明了癫痫患儿粪便微生物组如何受KD的影响，研究结果引起了人们对饮食以及肠道菌群和整体健康影响的关注，意义重大。
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