科研 | 中国医科院放射医学研究所：口腔微生物群影响结直肠癌小鼠模型的放疗疗效和预后（国人佳作）
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编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。
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放疗不可避免地与各种影响癌症患者生活质量的副作用交织在一起。本研究报道了口腔微生物群的改变可能会影响原发性直肠癌和结直肠癌(CRC)肝转移的治疗疗效和预后，这些转移在病理上破坏了胃肠道的完整性和功能。16S rRNA测序显示，在CRC小鼠模型中，口腔微生物群的改变会导致肿瘤内的肠道细菌组成发生改变，但不会改变邻近肿瘤周围组织的细菌组成。特别是口腔具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum) 向CRC位点迁移，影响放疗的疗效和预后。给药一种特殊的抗生素甲硝唑，消除了口腔微生物组波动对CRC放疗的不良影响。口腔菌群也通过肠道微生物与辐射诱导的肠道损伤相关。我们的研究结果表明，口腔微生物组与其肠道微生物组的协同作用影响CRC放疗的疗效和预后。
论文ID
原名：Oral microbiota affects the efficacy and prognosis of radiotherapy for colorectal cancer in mouse models
译名：口腔微生物群影响结直肠癌小鼠模型的放疗疗效和预后
期刊：Cell Reports
IF：9.423
发表时间：2021.10.26
通讯作者：崔明＆樊赛军
通讯作者单位：中国医学科学院/北京协和医学院放射医学研究所
DOI号：10.1016/j.celrep.2021.109886
实验设计
结果
为了诱导自发性CRC，小鼠暴露于氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS;图S1A)，然后在特制的笼子中饲养，以避免排泄物微生物组可能因粪养对口腔菌群的影响(图S1B和S1C)。为了确定口腔微生物群是否影响CRC的进程，根据疾病严重程度和病理表现(如体重减轻、直肠出血、粪便不一致)将小鼠分为两组。与轻症组相比，严重组小鼠结肠较短，肿瘤更多、更大(图1A-1D)，组织损伤更严重(图1E)。
然后我们比较了不同疾病严重程度(轻微和严重)的健康正常和患病动物的口腔细菌组成。与健康正常对照相比，轻度疾病动物口腔细菌多样性增加，病情进展较严重的动物口腔细菌多样性进一步增加(图S1D-S1H)。β多样性分析揭示了三个不同队列之间口腔细菌类群组成的详细差异(图1F和1G)。此外，主坐标分析(PCoA)显示三组口腔菌群明显分离(图1H和S1I)。具体来说，与轻症组小鼠相比，严重组小鼠口腔中拟杆菌属（Bacteroides）、孪生球菌属（Gemella）和链球菌属（Streptococcus）在属水平上相对丰度较低(图1I-1L)，表明口腔微生物群模式可能与CRC的发生有关。
在全腹照射(TAI)后，我们重复进行口腔微生物群移植(OMT) 10天，以改变接受小鼠的口腔微生物群，并检测OMT对CRC放疗疗效的影响(图S1J和S1K)。尽管所有实验动物最初有相似的口腔微生物群(图S2A-S2D)，与对照组相比，辐射暴露后第14天，CRC小鼠的α和β多样性增加。然而，在TAI后，OMT显著降低了CRC小鼠的α多样性并提高了β多样性(图2A, 2B和S2E-S2I)。未加权PCoAs和加权PCoAs显示，TAI促进口腔微生物组成的显著差异，而OMT促进口腔微生物的分离(图2C和S2J)，表明OMT重组了小鼠口腔微生物组成。例如，OMT降低了辐照后属水平Bacteroides和Gemella的相对丰度，增加了Streptococcus的相对丰度(图2d-2G)。
然而，OMT显著缩短了结肠长度，表明口腔微生物组改变可能对辐射诱导的结肠炎有不利影响(图2H和2I)。此外，OMT也阻碍了辐照的肿瘤杀伤作用。正如预期的那样，根据肿瘤数量和大小的减少以及Ki-67(增殖标记物)、血管内皮生长因子(VEGF)(血管生成标记物)和C-X-C趋化因子配体1(CXCL1，一种免疫细胞介质)的相关蛋白水平来判断，TAI显著减少了AOM/DSS诱导的肿瘤发生(图2J-2M)。ELISA检测显示，OMT提高了照射后结直肠中促炎细胞因子的产生(图2N和2O)。由于盆腔和腹腔放射治疗经常与不可避免的副作用相关，我们确定了OMT如何影响辐射诱导的胃肠道毒性。OMT显著加重了辐射诱导的胃肠道毒性，这可以从短的小肠绒毛和稀疏的结肠结构(图S2K)，促炎细胞因子升高(图2P和S2L-S2N)，以及小肠上皮完整性受损(图2Q, S2O和S2P)来判断。我们的研究结果表明，在CRC的临床治疗中，口腔微生物群的致病成员可能会损害放疗的疗效。
为了确定口腔菌群组成是否与结直肠癌肝转移相关，手术将HCT-8细胞注入裸鼠脾脏。如图2R和2S所示，12 Gy TAI减少了肝转移灶的肿瘤面积，经OMT治疗后，肿瘤面积反而恢复。免疫组化染色进一步证实，OMT加重了放疗后CRC肝转移组织中Ki-67、VEGF和Bcl-2(一种抗凋亡标志物)的蛋白水平(图2T和2U)，支持口腔病原体对放疗后CRC肝转移的致病影响。
3 口腔微生物群的变化与肠道微生物群有关
接下来，我们分析了CRC位点和邻近的非恶性部位(盲肠)的细菌分类学比例，以阐明口腔微生物群对放疗效果不利的机制。OMT增加了TAI小鼠CRC位点内细菌的α多样性(图S3A和S3E)，但降低了β多样性(图3A和3B)。PCoA进一步显示，OMT通过增加布劳特氏菌属(Blautia)、Lachnospiraceae_NK4A136_group和链球菌(Streptococcus)在属水平上的相对丰度，形成了CRC位点(图3C和S3F)的微生物群组成(图3D-3G)。接下来，我们评估了盲肠的细菌分类比例，发现OMT没有改变CRC区域外盲肠细菌的α多样性和β多样性(图3H和S3g-S3K)。PCoA图显示OMT小鼠盲肠细菌呈交错分布(图3I和S3L)，表明盲肠在属水平上的相对丰度没有变化(图3J)。这一证据表明，CRC部位的微生物可能被口腔微生物群改变。
口腔微生物群的改变没有改变胃肠道的活性氧(ROS)状态(图S4A和S4B)，也没有改变CRC诱导的结直肠致癌基因的表达水平(图S4C和S4E)，这意味着一些口腔微生物病原体可能会对放疗疗效产生不利影响。考虑到梭杆菌属(Fusobacterium)在结直肠中的致癌作用，我们研究了Fusobacterium是否参与了OMT衍生的CRC放射抗性。因此，我们使用16S rRNA测序分析比较了正常小鼠和AOM/DSS小鼠粪便提取物中梭杆菌的频率。梭杆菌属在属水平上丰度较高(图S4F)。此外，16S rRNA测序显示，在OMT处理小鼠的CRC位点的属水平上，Fusobacterium进一步富集，而在CRC周围盲肠组织中没有富集，表明Fusobacterium参与了AOM/DSS诱导的小鼠模型的CRC发生(图4A和4B)。尽管没有统计学意义，Flemer等人报道了临床样本中CRC患者口腔黏膜中Fusobacterium的含量低于健康对照组。与此同时，严重CRC组和OMT治疗组、放疗抗性CRC组的动物口腔中梭杆菌的频率相对较低(图S5A和S5B)。因此，我们在体外培养了具核梭杆菌(F. nucleatum)，并将这种厌氧病原体分布到AOM/DSS诱导的CRC小鼠口腔中。虽然TAI降低了CRC位点的F. nucleatum丰度，但口腔内F. nucleatum的补充也导致了该细菌在CRC位点的富集(图4C)。虽然F. nucleatum补充没有改变结肠长度(图4D和4E)，但F. nucleatum补充剂可能通过促进致瘤组织中的Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白水平的增加(图4H和4I)，削弱放疗的杀瘤作用，并不利地增加了肿瘤的数量和体积(图4F和4G)。ELISA分析证实，口服F. nucleatum可促进照射后的结肠炎症(图4J和S5C)。最后，我们还评估了口服F. nucleatum对放射诱导的胃肠道毒性的影响，结果显示，口服F. nucleatum的积累加重了肠炎(图S5D-S5G)，恶化了上皮完整性(图S5H-S5J)和肠道结构(图S5K)，表明F. nucleatum影响CRC放疗的疗效和预后。
通过在脾脏注射HCT-8癌细胞后进行肝转移实验，我们进一步评估了F. nucleatum在CRC肝转移对放疗抗性中的致病作用。F. nucleatum给药显著提高了转移性肝组织的转移负担，并提高了转移性肝组织中蛋白水平(Ki-67、VEGF和Bcl-2)(图4K-4N)，表明F. nucleatum处理阻碍了放疗减少肿瘤转移的疗效。
图4 口腔F. nucleatum (Fn)诱导CRC放射抗性。(A)采用16S rRNA测序法测定CRC位点Fusobacterium的相对丰度。显著性差异：*p＜0.05；两组间双侧Student’s t检验，每组n=8。倍数变化与“TAI”组相关。(B)采用16S rRNA测序法测定盲肠Fusobacterium的相对丰度。倍数变化与“TAI”组相关。(C) q-PCR检测小鼠CRC位点F. nucleatum的丰度。显著性差异：*p＜0.05，***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。倍数变化与“Con”组相关。(D和E)三组小鼠F. nucleatum给药14天后测量结肠组织长度；每组n=10。(F和G) 显示经F. nucleatum处理和照射后CRC负荷小鼠肿瘤。显著性差异：**p＜0.01，***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。(H和I)不同组小鼠CRC组织中具有代表性的Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫组化；比例尺，75 μm。显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01；两组间双侧Student’s t检验。(J) ELISA法检测小鼠结肠组织中IL-6的表达水平。显著性差异：**p＜0.01；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。(K和L) F. nucleatum对照射后HCT-8细胞注射裸鼠肝脏肿瘤发生的影响。显著性差异：*p＜0.05，***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验，每组n=6。倍数变化与“Con”组相关。(M和N) CRC肝转移性组织中Ki-67、VEGF、Bcl-2蛋白免疫染色的代表性图像和染色强度；比例尺，75 μm。显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验。参见图S4和S5。
为了克服口腔微生物介导的放射抗性，小鼠暴露于甲硝唑(MTZ)，一种Fusobacterium-killing抗生素，以根除胃肠道中的Fusobacterium。首先，我们将F. nucleatum菌株添加到AOM/DSS处理小鼠的口腔中。与F. nucleatum处理组相比，MTZ给药可恢复F. nucleatum诱导的结肠损伤(图5A和5B)，并显著降低照射后的肿瘤数量和体积(图5C和5D)以及相关蛋白水平(Ki-67、VEGF、CXCL1)(图5E和5F)。重要的是，MTZ治疗导致口腔和CRC部位F. nucleatum的相对丰度降低(图5G和5H)。
其次，我们采用OMT进一步评估MTZ对结直肠癌的放射增敏作用。正如预期的那样，MTZ治疗减轻了TAI小鼠的结肠炎(图5I和5J)和结肠损伤(图S6A)。重要的是，口服MTZ可以抑制由口腔微生物群失衡引起的CRC放射抗性，并显著降低肿瘤大小(图5K和5L)和Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白水平(图5M和5N)。MTZ治疗还能保护口腔菌群变化导致加重胃肠道毒性，同时减少炎症(图S6B-S6E)，改善上皮细胞(图S6F-S6H)和肠道完整性(图S6A)。MTZ处理后第14天，两组肠道细菌多样性差异显著(图S6I-S6L)。虽然非加权和加权Unifrac分析没有描述肠道菌群组成的显著变化(图5O和S6M)，但非加权和加权的PCoA图表明，在MTZ给药后，TAI小鼠的肠道菌群组成明显分离，口腔菌群发生改变(图5P和S6N)，这表明MTZ可能塑造了细菌的组成。具体来说，口服MTZ降低了口腔和CRC位点Fusobacterium在属水平的相对丰度(图5Q和5R)。热图分析进一步表明，MTZ处理导致辐照小鼠OMT给药后，Blautia和Odoribacter在属水平上的相对丰度降低(图5S)。重要的是，我们分析了其他CRC 细菌的变化，16S rRNA测序显示，无论有无MTZ处理，CRC位点卟啉单胞菌属(Porphyromonas)和嗜胆菌属(Bilophila)的相对丰度都非常低且没有变化，表明这两种细菌在该系统中没有发挥重要作用(图S6O和S6P)。此外，MTZ给药后Bacteroides的频率增加，说明细菌与MTZ诱导的辐射敏感性无关(图S6Q)。综上所述，这些结果表明口服MTZ改变了口腔菌群移植介导的肠道细菌结构的变化。由于Fusobacterium促进自噬，我们评估了小鼠结肠LC3I和LC3II的表达水平。如图5T所示，OMT提高了LC3-II:I的表达比例，MTZ治疗消除了LC3-II:I的表达比例，进一步表明Fusobacterium可能参与了口腔微生物群介导的CRC放疗抗性。
图5 MTZ可改善OMT治疗CRC的不良疗效。(A、B)两组小鼠结肠解剖照片及长度。显著性差异：*p＜0.05；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。(C和D)不同条件下CRC负荷小鼠肿瘤情况。显著性差异：*p＜0.05；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。(E和F)不同组小鼠CRC组织中Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫组化；比例尺，75 μm。显著性差异：**p＜0.01，***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验。(G和H)用q-PCR方法检测TAI Fn组和TAI Fn MTZ组口腔样本及CRC位点F. nucleatum的相对丰度。显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。倍数变化与“TAI Fn”组有关。(I和J) 4组小鼠解剖结肠照片和定量数据。显著性差异：*p＜0.05；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。(K和L)不同条件下CRC负荷小鼠的肿瘤。显著性差异：***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验，每组n=10。(M和N)不同组小鼠结肠Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫组化；比例尺，75 μm。显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01；两组间双侧Student’s t检验。(O)采用非加权Unifrac比较肠道细菌β多样性。显著性差异：Wilcoxon秩和检验；每组n = 8。“day 14”为MTZ治疗小鼠14天。(P) 未加权PCoA分析MTZ处理第14天结直肠癌部位肠道细菌组成结构的变化。显著性差异：AMOVA，每组n = 8。“day 14”为MTZ治疗小鼠14天。(Q和R)通过16S rRNA测序检测口腔样本(Q)和CRC位点(R)中Fusobacterium属水平的相对丰度。显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01；两组间双侧Student’s t检验，每组n = 8。“day 14”为MTZ治疗小鼠14天。倍数变化与“TAI OMT d14”组相关。(S)采用16S高通量测序法评估各组肠道菌群属水平的变化，每组n=8。热图是基于行Z得分的颜色。细菌水平最低和最高的小鼠分别用蓝色和红色表示。显著性差异：Wilcoxon秩和检验，每组n=8。“day 14”为MTZ治疗小鼠14天。(T)采用ELISA法检测小鼠结肠LC3II/I水平。显著性差异：***p＜0.001；两组间双侧Student’s t检验，每组n=12。参见图S6和表S2。
接下来，我们分析了在特制的笼子中饲养的小鼠的口腔细菌分类比例。TAI降低了α多样性，导致未加权PCoA对口腔微生物的显著分离(图S7A-S7J)，表明TAI可能会轻微波动口腔细菌组成。虽然口腔菌群的α多样性没有显示出显著的变化(图S7K-S7M)，但非加权Unifrac分析显示OMT给药后β多样性显著增加，非加权PCoA验证了口腔菌群的变化(图7A和7B)，表明OMT确实改变了TAI暴露小鼠的口腔微生物群。具体来说，热图和MetaStat分析显示，OMT给药后，辐照小鼠口腔中Lachnoclostridium和阿克曼氏菌(Akkermansia)在属水平的相对丰度下降(图7C-7E)。
最后，我们比较了含有不同口腔菌群的辐照小鼠的肠道菌群。TAI降低了肠道细菌的丰度，而OMT消除了TAI在某些肠道细菌中引起的这种减少(图S7N-S7P)。此外，非加权Unifrac分析表明，TAI增加了肠道细菌的β多样性，而OMT再次减弱了β多样性(图7F)。非加权PCoA进一步验证了TAI型肠道细菌模式通过口腔菌群改变重塑(图7G)。有趣的是，热图和MetaStat分析进一步表明，OMT处理后粪便样本中Lachnoclostridium在属水平上的相对丰度升高，Akkermansia在属水平上的相对丰度降低(图7H-7J)，表明口腔微生物可能迁移和转移到下消化道。我们的观察表明，口腔-肠道菌群轴有助于辐射诱导胃肠道损伤的预后。
讨论
放射治疗是治疗局部实体肿瘤的最有效的细胞毒性治疗方法，在治疗过程中接受放射治疗的癌症患者将达到一半。放疗是手术根除前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤的主要辅助治疗方法，也是头颈部、肺癌、膀胱癌等肿瘤的首选局部治疗方法。CRC占全球每年癌症相关发病率和死亡率的10%。放疗、化疗和手术切除通常可以联合使用，以对抗CRC和相关转移，因为放疗通常可以降低手术切除肿瘤前的局部复发风险。然而，放疗往往与各种不良副作用相关，如胃肠道毒性，包括腹泻、肠炎和吸收不良，不可避免地损害了癌症患者的生活质量。因此，重要的是制定策略来提高治疗效果，同时减少放射治疗的相关副作用。以往的研究表明，肠道菌群可能参与了CRC的发生和转移，但其口腔对等物，口腔菌群在CRC中的作用一直被忽视。因此，我们提供令人信服的证据支持这一概念，CRC的状态受口腔细菌群落的影响，而细菌群落的操纵可能会影响CRC组织对辐照的敏感性，这提出了口腔卫生在与CRC和相关疾病斗争中的重要性的重要问题。
人类消化道是共生菌群的家园。从口腔到直肠，大量的微生物寄居在宿主体内，与宿主相互作用，维持新陈代谢、免疫和内分泌功能的稳态。口腔微生物群是口腔的重要组成部分，在防止可能影响全身健康的外部细菌定植方面起着重要作用。越来越多的证据表明，多种因素，如宿主免疫能力、饮食和环境影响，共同形成了互利的口腔微生物-宿主改变。我们和其他人之前的研究已经证明腹部照射会对小鼠的肠道菌群产生不利影响。在本研究中我们报告了全腹照射后口腔微生物群的变化，并揭示了一种口腔微生物病原体在结直肠癌中的致病作用。我们的发现与以往的观点一致，即口腔微生物群与多种口腔疾病有关，如龋齿、牙周病、口腔癌和低消化系统疾病，包括CRC、肝癌、胰腺癌和炎症性肠病(IBD)。现在看来，口腔微生物群可以入侵和定殖消化道的任何部分，损害宿主的健康。通过人工操作口腔菌群，我们证明了口腔微生物组可能能够驱动下消化道细菌分类比例的波动，在那里这些病原体损害放射治疗CRC和CRC肝转移的疗效。因此，口腔卫生培训和管理可能有助于在临床环境中对抗CRC和相关疾病。
具核梭杆菌(F. nucleatum)是口腔中最常见的菌种之一，与口腔炎症相关，包括牙周炎和牙龈炎。在与CRC相关的微生物中，F. nucleatum因其在CRC组织中过多而备受关注。有研究表明，F. nucleatum通过梭杆菌外膜蛋白A (FomA)、梭杆菌粘附素A (FadA)和梭杆菌自身转运蛋白2 (Fap2)等毒力因子粘附于内皮细胞和上皮细胞，支持在CRC中口腔F. nucleatum的致病作用。在本研究中，我们证实了在AOM/DSS小鼠的粪便颗粒中，Fusobacterium的丰度显著升高。此外，我们还发现口腔菌群改变会降低放疗疗效，并促进结直肠癌部位Fusobacterium的富集，这意味着Fusobacterium可能起源于口腔菌群，并在肠道中富集。MTZ对脆弱拟杆菌(B. fragilis)、Clostridium spp.、Fusobacterium spp.和Bacteroides spp.等专性厌氧菌具有良好的活性，是治疗口腔结肠炎和感染的理想选择。放疗联合MTZ治疗的CRC小鼠总肿瘤负荷和放射性肠炎均降低。重要的是，MTZ处理降低了CRC部位F. nucleatum的相对丰度。既往研究表明，Fusobacterium部分通过刺激自噬促进CRC放疗抗性。在本研究中，我们证实口服补充Fusobacterium可导致辐照小鼠结肠中LC3-I向LC3-II转化的升高，而这种转化被MTZ等抗生素的共同给药所消除。我们的实验证实，口腔F. nucleatum可能会迁移并定位在CRC位点，从而导致CRC的放射抗性。我们的研究表明，口腔微生物群干扰放疗治疗CRC和相关肝转移的疗效。表现出不同严重程度CRC的动物有不同的口腔细菌模式。口腔微生物群移植可改变结直肠癌部位的细菌群落，但对瘤周微环境无影响。可见，F. nucleatum可在结直肠癌部位迁移和定殖，从而逐渐形成对放疗的抗性，但可通过联合给药(如MTZ)而被阻断。总的来说，我们的发现为口腔微生物群在损害放疗中的致病作用提供了见解，并巩固了口腔-肠道菌群轴紧密相互作用的重要性。在临床上，结合良好的口腔卫生习惯和适当的抗生素使用，口腔F. nucleatum可作为一种潜在的生物标志物和靶点用于CRC的诊断和治疗。
本研究的局限性：本研究的局限性在于辐照的技术处理，不能准确定位原发性直肠癌和结直肠癌肝转移部位。本研究的另一个局限性是缺乏临床CRC样本来验证小鼠模型的实验结果。