探讨新型隐球菌脑膜炎不同检测方法的诊断价值
新型隐球菌脑膜炎（CNM）是由新型隐球菌感染脑膜和（或）脑实质所致，属于中枢神经系统亚急性或慢性炎症性疾病。常见首发症状以头痛、头晕、呕吐和发热为主，由于其颅内感染时症状的不典型性及治疗的不规范，误诊率及病死率仍较高。
近年来随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛或不适当应用，免疫缺陷性疾病及器官移植患者的增加，该病呈增长趋势。在流行病学上，新型隐球菌属于一种机会性感染真菌，病原体多从呼吸道吸入，形成肺部病灶后经血液循环播散于脑膜。
据文献报道，隐球菌性脑膜炎发生率和死亡率在发达国家达到10%～30%，在发展中国家可达到50%～100%。因此，临床早期快速准确地诊断对于隐球菌脑膜炎的鉴别和诊断很有必要。
目前墨汁染色对新型隐球菌的实验诊断依然为一种有效的经典诊断方法，但需较多标本量离心处理后收集沉淀，制片墨汁负染后进行镜检，因而标本处理繁琐、耗时，且结果判断主观性较大。
真菌培养法为新型隐球菌检测的基本方法，但敏感性低，耗时较长。上世纪80年开始乳胶凝集方法检测血清和脑脊液中新型隐球菌荚膜多糖的定性或半定量的方法，但操作步骤繁琐，结果判定主观性也较大。
胶体金方法是继乳胶凝集方法后建立的检测新型隐球菌的方法，IMMY公司于2009年研发了胶体金方法试剂盒，其在常温下性状稳定，技术要求低，操作简单，检测时间短，结果易判读。国内临床检测和流行病学研究多使用乳胶凝集方法进行检测，而近年来采用胶体金方法进行检测新型隐球菌感染诊断逐渐得到推广。
为了客观评价目前新型隐球菌检测方法在临床检测中的应用价值，并探索降低假阳性的方法，本研究以墨汁染色、隐球菌培养、胶体金方法进行敏感度和特异性比较，并分析新型隐球菌诊断方法在脑膜炎鉴别诊断中的作用。
1.1 研究对象
根据病史、临床症状、体征、实验室检查和病原学检查 (墨汁涂片或培养阳性) 以及抗生素和抗结核药物治疗无效，改用抗真菌药物治疗有效，确诊为隐球菌性脑膜炎47例（其中21例经脑脊液真菌培养，39例经墨汁染色确诊的隐球菌性脑膜炎，其余8例是病例跟踪及后期临床动态观察确诊）（诊断标准依据2010年中国真菌学杂志发表的《中国隐球菌诊治专家共识》）。病例来自于2016年1月至2017年12月广东三九脑科医院神经科住院患者，其中男34例，女13例，年龄20～70岁。所有脑脊液标本均为第一次腰穿留取均在抗真菌药物使用之前。对照组共60例（其中脑脊液常规生化正常非神经系统感染20例、经临床确诊为结核性脑膜炎的脑脊液20例、及化脓性脑膜炎为细菌感染且无真菌感染20例。
1.2 仪器和试剂
隐球菌抗原检测试剂盒（胶体金免疫层析法）为美国IMMY有限公司产品；印度墨汁染液由贝索公司提供。隐球菌真菌肉汤为广州市迪景微生物科技有限公司生产。
1.3 检测方法
1.3.1 隐球菌抗原胶体金法
依据试剂产品说明书，试管中加入1滴样本稀释液，脑脊液经过离心（3000r/min) 10min后取上清40μl加入试管，插入试纸条，10min后读取结果。出现一条质控线为阴性，质控线与检测线同时出现为阳性，只出现检测线而无质控线则检测失败。
1.3.2 隐球菌墨汁染色镜检
根据墨汁染色标准操作，墨汁染液选用印度墨汁，将3ml以上的脑脊液离心（3000r/min) 10min，沉渣以5:1比例与墨汁混匀镜检，在黑色背景下可见到透亮的菌体和宽厚荚膜。
1.3.3 隐球菌培养和鉴定
依据第四版《全国临床检验操作规程》，培养脑脊液3～5ml接种到真菌肉汤，阳性标本接种沙堡弱葡萄糖琼脂 (SDA) 培养基35℃培养2～5d分纯后进行菌种的鉴定。
2.1 隐球菌胶体金法、墨汁染色和隐球菌培养试验的灵敏度及特异性
47例最终被确诊的隐球菌脑膜炎中，隐球菌胶体金法灵敏度100%，特异性98.33%；墨汁染色灵敏度65.95%，特异性98.33%；隐球菌培养灵敏度63.63%，特异性100%。
2.2 隐球菌胶体金法、墨汁染色和隐球菌培养试验在隐球菌组和对照组中的检测结果
在隐球菌组中，隐球菌胶体金法阳性47例、墨汁染色阳性31例、隐球菌培养21例（其中共33例培养，阳性21例结果均为新型隐球菌）；对照组中除化脓性脑膜炎脑脊液中，隐球菌胶体金法阳性1例、墨汁染色阳性1例，隐球菌胶体金法、墨汁染色、隐球菌培养其余均无阳性结果。见表1。
表1：胶体金法、墨汁染色和培养试验在各组中的检测结果
新型隐球菌脑膜炎的患者，典型表现为重度的头痛；头痛可持续数周至数月，伴有精神状态、性格的改变，发热，嗜睡和昏迷。多数资料显示隐球菌感染和使用广谱抗生素、激素、免疫抑制药的广泛或不适当有关，以及免疫缺陷性疾病及器官移植患者的几率高，但是我院首发症状按头痛在神经内科就诊患者病史中禽鸟类接触者占多，特别是鸽子饲养者，隐球菌主要在鸽粪和被鸽粪污染的土壤中大量存在，并无其他系统疾病引发，但是因为数据有限，无法进行流行学统计。
临床症状与结核性脑膜炎不易鉴别，易误诊为结核性脑膜炎，对于阴性脑脊液检查结果，临床又高度怀疑隐球菌颅内感染患者，不能轻易排除该病。
隐脑患者的脑脊液可呈典型的“三高一低”脑膜炎表现，但无隐球菌性脑膜炎的特异性。诊断除了临床表现外，目前临床常用检查方法主要包括脑脊液常规、生化等一般检查、隐球菌荚膜多糖抗原检测、脑脊液墨汁染色、真菌培养和影像学检查等。墨汁染色是一种传统的方法，可把隐球菌荚膜染成透明。
印度墨汁染色的敏感性和特异性不一，常依赖于观察者的经验，在化脓性脑膜炎中有1例因荚膜抗原呈现假阳性，裂解的白细胞被误认为真菌。隐球菌培养和墨汁染色阳性是隐球菌性脑膜炎的确诊依据，但真菌培养和鉴定的周期较长 (3～7d) ，且阳性率较低 (55%～80%) 。
本研究结果显示隐球菌脑膜炎患者初次腰穿，胶体金法较上述2种“金标准”法更为敏感，可达100%，适应于临床排除诊断，对于初次腰穿脑脊液胶体金法阳性，而脑脊液涂片、脑脊液真菌培养阴性的中枢神经系统感染患者，应高度警惕隐球菌颅内感染的可能，需多次腰穿查找病原体。表1示对照组中1例临床确诊为化脓性脑膜炎患者，胶体金法阳性，多次脑脊液培养均未检出隐球菌但是培养出细菌，提示胶体金法检测新型隐球菌脑膜炎虽然有很好的敏感性，但也可能出现假阳性。胶体金检测方法脑脊液与抗原可能交叉反应，易被误诊为新型隐球菌性脑膜炎，需结合其它检测方法进行诊断，原因尚须进一步研究。
我们认为，隐球菌荚膜多糖抗原的胶体金免疫层析法最大价值是对新型隐球菌脑膜炎的早期诊断提供思路、线索和依据。依据三种方法各自局限性，联合三种方法检测值得临床推广。
隐球菌荚膜多糖抗原的检测，根据现有文献报道，具有高达90%以上的敏感度及特异度，已经作为隐球菌性脑膜炎确诊的依据。跟踪病例发现，大部分患者荚膜抗原转阴长达半年以上，部分患者长期治疗后抗原却一直存在体内。研究荚膜抗原检测对疾病预后价值的评估以及抗原检测转阴或者滴度效价的变化后的停药节点等问题，还有待于进一步扩大临床病例进行深入研究。