Co-IP 实验Q&A宝典

背景

要点

裂解翻转于低温，避免降解是根本。

抗体珠子需加足，抗体蛋白过夜孵。

蛋白丰度了于心，重链轻链已变性。

Protocol与datasheet，研读操作需仔细。

常见问题解析

01

免疫共沉淀（Co-IP）与免疫沉淀(IP)的区别  

IP

Co-IP

IP：通过对某蛋白质的富集，研究该蛋白的特性（如翻译后修饰）。

Co-IP: 通过对某蛋白质的富集，研究与其结合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白复合物等）。

▶ 关键试剂选择：使用可以富集蛋白的抗体是Co-IP的前提，因此，适用于IP的抗体都可应用于Co-IP。

02

Co-IP与Gst pull-down的区别   

Co-IP：利用抗原抗体反应的特异性；

GST Pull down：一般指用一个带GST标签的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物。

03

免疫共沉淀中的input是指什么？阴性对照的意义是什么？ 

input是阳性对照。免疫共沉淀实验中，会直接取细胞裂解液进行WB，用于验证细胞裂解液中确实存在目的蛋白。阴性对照是用来排出污染的可能性， 当阴性对照（即lgG对照）没有出现阳性说明没有非特异性的蛋白，当对照出现阳性，说明抗体有非特异结合的可能。

04

免疫共沉淀中ProteinA/G琼脂糖珠有何作用？

ProteinA/G能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段，因此能和抗体结合，而抗体与目标蛋白结合，目标蛋白和相互作用的蛋白结合。

05

Co-IP实验中如何去除重链轻链的影响？

1. 靶标蛋白与抗体重链（55kD)、轻链(25kD)分子量差别很大 ;

2. IP抗体：将IP抗体固定于磁珠上 ;

3. WB抗体：IP捕获抗体（如鼠源）与WB检测一抗（如兔源）选用不同种属来源的抗体（初级方案）；

4. 特殊二抗：传统二抗可识别变性的重轻链， 而 Protein A/G-HRP 二抗仅结合完整的IgG。
18-160 | Protein A, HRP conjugate
18-161 | Protein G, HRP conjugate
特殊二抗：链型特异或构象特异的二抗。用抗Fab和 Fc 抗体特异性封闭轻链和重链。

06

Co-IP实验两个抗体需要不同种源吗? 

最好选择两个不同种源的抗体。选择同一种源的抗体的问题在于：在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链间的二硫键破坏, 从而使抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD， 如果目的蛋白在55KD或25KD附近，则IP抗体的重链或轻链和目的蛋白会重叠在一起，无法分辨。

07

进行IP反应时，抗体、磁珠的加样和反应顺序会对最终结果有影响吗？

一般有三种反应顺序：

1.样本+抗体先反应，然后加磁珠；

2.抗体+磁珠先反应，然后放入样本中；

3.样本+抗体+磁珠同时反应。

推荐使用第一种和第二种，差别不大。不推荐用第三种，第三种方式虽然可以减少反应时间，但有实验表明同时加入三个组分的方式会使最终的结果变差。

Trouble shooting

高背景

制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体

▶ 制备样品后进行短暂超声处理（3次，每次5秒钟），然后离心纯化，取上清后进行后续试验

洗涤不彻底

▶ 多次洗涤，并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度

非特异性蛋白吸附于珠子上

▶ 进行Preclearing以排除非特异性吸附

抗体本身特异性不好

▶ 选择合适的抗体，可以考虑单抗

使用了太多的抗体

▶ 进行条件优化减少抗体

使用了过多的细胞或组织进行裂解

▶ 减少样本量，我们推荐100-500μg细胞裂解物

抗原降解

▶ 保证样品中加入了蛋白酶/磷酸酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品

WB步骤

▶ 使用规范的WB,注意封闭、一二抗稀释的条件

无信号

目的蛋白在样本中表达量低或者不表达

▶ 首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理。

▶ 胞内蛋白互作的水平较低或没有互作，增加蛋白裂解物或进行诱导处理。

细胞裂解液使用不当

▶ 根据实验需要选择，慎重考虑。

目的蛋白未被洗脱

▶ 保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和pH值合适。

抗体没有很好的与珠子相互结合

▶ 选择合适的珠子。

抗体选择不当或者不工作

▶ 利用WB对抗体进行验证

抗体使用不足

▶ 查阅文献或者说明书，并多次优化或选择合适的抗体使用量。