SBB：小麦根际整体细菌多样性和含phoD细菌对磷肥的响应
本文转载于土壤微生物组，作者 侯亚荣
1摘要
在农业生态系统中施用磷肥不仅影响作物产量，还影响相关的土壤微生物群落。细菌phoD基因编码碱性磷酸酶(ALP)，在土壤有机磷分解中起重要作用。然而，长期施磷对细菌phoD基因群落、细菌总群落的影响，以及这些群落与土壤性质的关系，在有效磷缺乏的黄土土壤中却知之甚少。本研究评估了无机磷施肥对土壤细菌群落的影响。16S rRNA和phoD基因是从小麦根际土壤中提取的DNA的靶基因，小麦根际土壤在14年中每年施用5种磷肥(0 (P0)、50 (P50)、100 (P100)、150 (P150)和200 (P200) Kg P2O5 ha-1 yr-1)。与P0处理相比，施磷处理增加了土壤有机碳(SOC)、微生物生物量碳(MBC)和有效磷(AP)，高磷处理(P150和P200)增加了总磷(TP)和有机磷(OP)，而碱性磷酸酶活性降低。所有磷肥处理都降低了细菌总多样性(香农指数)。然而，与P0处理相比，只有P200减少了具有16S rRNA基因的OTUs的数量，并且不施磷处理影响了含磷细菌的OTUs和多样性。此外，与P0相比，施磷处理改变了16S rRNA和phoD基因细菌群落组成。微生物网络分析表明，高磷处理(P150和P200)减少了16S rRNA基因在属级微生物网络中的连接数目。主坐标分析表明施磷处理改变了细菌群落的整体结构，冗余分析表明土壤溶解有机碳和磷水平与细菌群落的整体结构显著相关。综上所述，本研究表明长期施磷显著影响土壤碳、磷以及小麦根际土壤中总的细菌群落和phoD基因细菌群落的组成，高施磷量降低了细菌总OTUs 、多样性和联系，可能影响土壤生物地球化学循环。
2 研究进展
中国农田黄土中的土壤总磷含量高达0.73g/kg，但它通常以植物无法获得的 形式存在。黄土中有机磷的占比高达25%-45%，是作物和微生物重要的磷源。
有机磷在利用前必须转化为无机磷，磷酸盐(Pho)调节子是参与无机磷管理的关键机制，由Pho调节子激活的最常见有:能够从有机磷中获得无机磷的胞外酶、特异性转运蛋白和参与营养物储存和保存的酶，包括Pst和Pit、酸性/碱性磷酸酶、磷脂酶等。
细菌已被证明能诱导碱性磷酸酶的产生，并且在碱性磷酸酶的产生中已鉴定出三种编码磷酸单酯酶的同源基因(phoA、phoX和phoD)，而磷酸单酯酶是一大类将有机磷转化为磷酸盐的酶。在土壤细菌中，phoD是16S rRNA宏基因组数据集中最常见的碱性磷酸酶基因，被认为是土壤中的关键碱性磷酸酶基因。
phoD基因群落对磷肥投入的反应在不同的环境地点和不同的试验条件下有所不同，大多数研究是在草原土壤上进行的，具有较高的有效磷和较低的酸碱度(< 7.0)，而在旱地农业领域进行的研究很少，例如在中国黄土高原的旱地，具有较低的有效磷(在未施磷的农田中低于10 mg/kg)和较高的酸碱度(约8.49)，特别是根际土壤中phoD基因的转移。
田间试验在陕西杨凌一个学校的农场，位于黄土高原的南部。土壤中钾含量很高，但存在有效磷亏缺。
3 材料和方法
田间试验始于2004年10月，2004-2008年施用过磷酸钙，2009-2018年施用重过磷酸钙。包括以下5个处理，共4个重复小区(每小区40平方米)：P0、P50、P100、P150、P200。在所有五个处理中，氮肥(尿素)以每年每公顷160公斤氮的比例施用。在小麦播种前，氮和磷肥都在土壤中撒播，并通过旋耕作为基肥掺入10厘米。
在小麦拔节期(2018年3月31日)，共采集了20个根际土壤样品，深度为0-20厘米。一个子样品风干，用于分析土壤的物理化学性质，另一个子样品立即储存在4°C用于土壤微生物生物量碳(MBC)和碱性磷酸酶的分析，储存在-80°C用于提取DNA。
4 结果
根际土壤pH值、TP、OP、AP、SOC、DOC、MBC和ALP活性在5个处理间存在显著差异。与对照(P0)相比，施磷处理增加了AP、SOC和MBC，只有高磷处理(P150和P200)增加了TP，但降低了ALP活性。对于土壤铵态氮、硝态氮和速效钾，五个处理间差异不显著。
基于16S rRNA基因宏基因组分析，与P0相比，P200显著减少了观察到的OTUs数量，而P150增加了OTUs数量和Chao1指数；所有施磷处理都显著降低了Shannon指数，P200处理的Shannon指数最低。此外，P0、P50和P100处理之间的OTUs或Chao1指数没有差异，五个处理之间的phoD基因细菌的这三个指数也没有显著差异。
对于16S rRNA来说，所有土壤样品中的优势门是变形菌，平均占所有序列的26.7%，紧随其后的是放线菌、酸细菌、拟杆菌和绿弯菌。在五个处理中，有一半的门的相对丰度有显著差异。对于前10个门，与P0处理相比，施磷处理显著增加了拟杆菌的相对丰度。在属水平上，所有土壤样品中的前5个属是Massilia, RB41, Sphingomonas, Pedobacter, Arthrobacter,总共平均占所有序列的19.0%。五个处理间前15个属的相对丰度存在显著差异。然而，与P0处理相比，只有P200处理改变了一些属的丰度。
平均98.0%的phoD基因序列被鉴定为来源于细菌，所有土壤样品中的优势门是变形菌、蓝细菌、厚壁菌和浮霉菌，平均占所有序列的68.6%。与P0处理相比，施磷处理对含磷细菌的组成影响不大，P50和P150处理中只有变形菌和放线菌的相对丰度分别降低。前五个优势属分别是Bacillus, Nostoc, Pirellula, Gloeocapsa ,Pseudomonas，占所有序列的25.0%。与P0处理相比，施磷处理增加了假单胞菌属、根瘤菌属、出芽菌属和极地单胞菌属的相对丰度，降低了孢子菌属的丰度。
以16S rRNA基因为基础的细菌不同菌群的聚类系数、程度在低p组显著高于高p组。而phoD细菌的程度和拓扑系数在低p组显著低于高p组。两者在低p组和高p组中的关键类群(属)也有所不同。
PCoA和PLS-DA揭示了16S rRNA基因的P处理之间的明显分离，并显示P0、P50、P100、P150和P200处理之间的总细菌群落结构存在差异，而没有观察到含phoD的细菌群落结构的显著差异。RDA结果还揭示了磷处理之间的明显分离，土壤DOC和P (AP、OP、TP和ALP)与总细菌群落结构显著相关，而没有环境因素与含有phoD的细菌群落结构显著相关
5 总结和讨论
施磷改变了总细菌群落结构，并导致高磷施肥处理(P200)中观察到的OTUs数量和所有施磷处理中的多样性(Chao1和香农指数)显著减少。在施磷量低于100kgP2O5每公顷，16S rRNA基因细菌的OTUs和多样性或者土壤ALP和TP没有显著差异。
phoD基因细菌的OTUs数和Chao1或香农指数没有显著差异，而phoD基因细菌的群落组成有显著变化。这些结果表明含磷细菌不像基于16S rRNA基因的细菌那样对磷肥敏感。磷细菌对磷肥的不同反应可能是由于磷肥的不同形式(肥料磷或矿物磷)、土壤类型和试验条件造成的。
在针对总土壤细菌获得的网络中，在高磷组中，属之间的相互作用和程度都降低了，因此，高磷施肥处理的土壤总细菌群落形成较小且不太复杂的网络，这表明高磷施肥处理的网络复杂性较弱，从而降低了总微生物群落的稳定性。对于含有phoD的细菌的微生物网络，高磷组增加了微生物网络中的连接数目，似乎是一个由高磷施肥形成的更强的网络。低磷组和高磷组细菌群落中的关键属也不同，虽然这些属相对丰度较低，但它们中的一些与土壤有机碳、有机碳、总磷、速效磷和碱性磷酸酶有显著的相关性。
RDA显示，总细菌群落的结构也与土壤生物地球化学性质DOC、AP、OP、TP和ALP密切相关，它们受施磷的影响，表明土壤磷和土壤碳是决定旱地小麦施氮量充足的土壤细菌群落结构的主要因素。携带phoD的细菌结构与任何环境因素都没有显著的相关性。表明所选择的土壤性质对土壤中细菌群落结构的影响很小。