【衡道丨干货】细胞学标本在分子检测中的应用

用于分子生物标志物测试的细胞学标本的使用不断发展，仔细注意分类标本可以最大限度地提高其产量，并减少重新活检的需要。

使用细胞学标本进行分子检测可以使患者免于重复或更具侵入性的手术。2017年「病理学与检验医学档案」在一个包含两部分的特刊中，聚焦于分子技术在细胞病理学标本中的各种应用^1-7，本文是其中一些具体的讨论。

将分子诊断测试整合到细胞病理学工作流程中

Aisner等人¹和Tian等人²的文章，讨论优化针对分子测试的细胞病理学工作流程。科罗拉多大学的Aisner及其同事强调，传统的工作流程已经发展，诊断是最重要的考虑因素。因此，小的活组织检查和细胞块可能被多次重新检测，特别是当有序免疫细胞化学（ICC）时，有时在分子测试前组织已经耗尽。此时有两种策略可以提供帮助：在第一次收到腊块时，切割出一些未染色的部分并限制ICC的使用。为了使标本得到适当处理，与临床医生的沟通至关重要：这一标本是主要用于诊断，还是用于对已知恶性肿瘤再行分子检测。也可以从实验室请求残留组织进行临床试验。 因此，即使在常规诊断病例中，组织的保存也可以减少对临床试验参与的重复活检的需要。

作者建议将小针芯活组织检查嵌入多个块中，以便于不同检测应用的组织分类¹。福尔马林暴露应该受到限制，尤其应该避免周末固定。除了至少一个细针抽吸通道外，还需要两到四个针芯。将FNA标本直接在福尔马林中冲洗或制备涂片。在针芯活检标本上，即使在相对较少的细胞样本中，只要在初始HE载玻片上有超过50个细胞，分子检测就是成功的。总体而言，实施保存用于分子测试样本的专用方案可能会增加工作量，但会提高分子检测的成功率。

纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Tian及其同事也建议同时进行针穿刺活检和FNA，并使用FNA针冲洗液制备细胞块。除了提供高质量的核酸外，细胞学标本还具有增加肿瘤细胞的额外优势，而间隔基质相对较少。他们使用通常可能丢弃的成分，以独特的方式准备一部分样本进行分子测试。将细胞块预处理的上清液高速离心。然后在制备细胞块和ThinPrep载玻片后将随后的沉淀与任何残留的细胞悬浮液合并用于DNA提取和分子测试。只有在没有其他合适的材料可用时才使用来自细胞学涂片的材料。DNA提取的脱蜡和洗涤步骤被确定为DNA丢失的关键点：因此，为了优化DNA产量，在裂解和蛋白酶K消化之前除去这些步骤。

从生物信息学的角度来看，Tian及其同事描述了福尔马林固定和非福尔马林固定标本之间拷贝数改变的差异检测，这是由于固定方法之间富含GC的区域的测序变化。因此，使用类似制备的对照对于拷贝数改变的适当解释是重要的。该问题通常不会影响标准突变分析。总体而言，使用其优化方案对肺细胞学标本进行综合分子检测，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究小组报告了90％的成功率。

细胞块

细胞块是细胞病理学实验室中恶性肿瘤检查的一个组成部分，哥伦比亚大学医学中心的Anjali Saqi讨论了细胞块制备的技术方面³。从标本采集开始，已经使用了各种培养基和防腐剂。盐水为以后将标本分类到培养物，流式细胞术或细胞学制剂提供了灵活性；然而，盐水中的时间会影响到组织结构和细胞学细节。其它的生理盐溶液，如Hank的缓冲盐水溶液，没有被提及。罗斯韦尔公园纪念研究所的防腐剂在需要进行后续培养和细胞遗传学研究时非常有用，但可能不易获得。福尔马林固定被证实可用于IHC和分子研究，但会导致DNA碎片化。与福尔马林相比，酒精固定导致相当或更好的核酸保存，但在有些IHC染色中导致不可靠的结果。

许多因素可能导致细胞块质量不行³。厚的，难以观察的组织碎片和凝块可能留在涂片上而不是被妥善分布到细胞块。手动细胞块制备方法可能导致用过量凝固剂（组织凝胶或血浆/凝血酶凝块）稀释样本以及由于不完整的颗粒形成而丧失细胞性。火棉胶袋技术似乎产生更大的细胞性。与传统方法相比，基于醇的自动化方法Cellient显示出相当或增加的细胞产量，尽管这种方法不易扩展，因为一次只能制备一个细胞块，每个需要45分钟。虽然直接涂片越来越多地用于分子检测，但福尔马林固定，石蜡包埋的细胞块更容易适应面向外科病理的工作流程。现行EGFR突变和ALK重排测试指南也推荐细胞蜡块，不过预计指南会有更新。

甲状腺

纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Zhang和Lin讨论了甲状腺FNA标本的分子检测⁴。目前的美国甲状腺协会指南建议，可根据临床情况对Bethesda系统进行分子检测，以报告甲状腺细胞病理学类型异常不明显（AUS / FLUS），滤泡性肿瘤（FN / SFN）或可疑恶性肿瘤。目前可用于甲状腺FNA标本的分子测试板各自具有不同的靶向和优缺点。

Veracyte的Afirma基因表达分类（GEC）测试测量信使RNA基因表达，具有高阴性预测值和低阳性预测值。来自Interspace Diagnostics的ThyGenX是一项多重PCR检测方法，针对涉及8个基因的100个突变和易位，包括BRAF，RAS和RET。与Afirma相比，ThyGenX具有较高的PPV和较低的NPV。ThyraMIR，也来自Interspace Diagnostics，是一种microRNA表达测试，旨在与ThyGenX阴性结果一起使用或在其后使用。如果ThyGenX和ThyraMIR均为阴性，则恶性肿瘤的风险从预测概率的32％降至6％。没有解决ThyraMIR测试的独立使用问题。ThyroSeq v2由匹兹堡大学开发并由CBLPath销售，是下一代测序方法，可评估14种基因，42种RNA融合和16种RNA表达基因的1000多个突变。在AUS / FLUS，其Bethesda描述的恶性率为5％至15％的情况下，ThyGenX具有高NPV和相对较低的PPV。因此，在这种情况下，ThyroSeq v2可能更好地作为恶性肿瘤的排除测试。ThyroSeq v2也具有高PPV，可能足以使其被认为是规则测试。第五种选择使用NGS Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2，它具有较高的NPV，但仅在有限数量的病例中进行了研究。

单基因BRAF或RAS检测不应该被忽视，因为在适当的背景下BRAF V600E突变被认为是乳头状甲状腺癌的诊断，而RAS突变在滤泡性肿瘤和非侵袭性滤泡性肿瘤中更常见，具有乳头状核特征或NIFTP。美国甲状腺协会指南不推荐用于甲状腺FNA的特定分子测试，并建议在该领域需要额外的长期结果数据。除了FNA测试之外，由甲状腺癌而非甲状腺正常分泌的促甲状腺激素受体的全血评估可能是不确定甲状腺结节的有用辅助手段。

肺免疫过氧化物酶试验

肺可能是分子检测临床应用中最明显的例子。纪念斯隆-凯特琳癌症中心的周，和该中心及纽约大学朗格医学中心的莫雷拉，在前述特刊上三篇关于肺部的文章的第一篇中，讨论了细胞学标本的免疫过氧化物酶（IPOX）测试⁵。作者对IPOX的使用包括IHC和免疫细胞化学，样本处理和分析中的几个因素影响成功使用以分子改变为目标的IPOX测试：酒精固定降低了IPOX准确性，福尔马林优化抗体降低了免疫原性，43%的抗原在酒精中丧失免疫原性。然而，方案的改变可以改善大多数抗原的免疫原性。将酒精固定的标本放入福尔马林（比如从液基细胞学标本制备FFPE细胞块）可恢复一些免疫原性。分析问题包括解释阳性染色的主观性，作者主张使用严格的定量截止值，没有讨论定量图像分析的使用。

肿瘤内异质性是分析误差的另一个来源，因为所有生长模式可能无法在小的活体组织或FNA标本上表现，并且不同的生长模式可能代表遗传上不同的，对于预后很重要的克隆。为此，作者建议扩大活体组织的受检部分和肿瘤区域的取样范围。具体解决的测试包括EGFR突变，ALK易位，ROS1易位，BRAF V600E和PD-L1 IPOX。除了PD-L1之外的所有这些都在文献中有成功用于细胞学标本的报道。细胞学标本中PD-L1的许多摘要已在最近的会议上发表，因此可能还有其他文献正在出版过程中。

通常，在某些情况下，分子改变特异性抗体可以在分子测试之前被视为筛选测试，因此减少了对更昂贵的分子测试的需要。然而，需要做更多的工作来确定这些测试对细胞学标本的临床效用。

肺FISH测试

瑞士巴塞尔大学医院的Savic和Bubendorf解决了荧光原位杂交在细胞学标本中的应用。有六大目前的分子检测指南建议使用福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤材料进行FISH检测。然而，Savic和Bubendorf认为这并不是因为FFPE是最优质的标本，而是因为分子病理学家对FFPE组织的接触较多，而细胞学标本的专业知识较少。在细胞学全细胞标本上进行FISH判读应该更清晰，具有更多的完整细胞核和更完整的核酸。FISH已成功应用于各种细胞学标本，包括常规或液体制剂，Papanicolaou或Giemsa染色的载玻片，以及免疫细胞化学后的标本。研究表明，FFPE和细胞学标本之间ALK解释的阈值相似。作者旁注称ALK IHC可能是ALK易位检测的合理替代指标，因为天然ALK不在非肿瘤细胞中表达。FISH能够检测其他重排，例如ROS1，RET，NTRK1和NRG1，以及MET的扩增。

除肺腺癌外，FISH可用于从细胞学标本上的反应性间皮细胞来发现间皮瘤。有趣的是，作者指出，染色体7的9p21缺失和多体性对于间皮瘤是特异性的，并且可以使用UroVysion FISH（Abbott Molecular）测定法检测。作者提出UroVysion可用于泌尿细胞学检查，以排除非典型尿路上皮细胞病例中的高级尿路上皮癌。

来自肺病理学会的肺部生物标志物测试视角

得克萨斯大学MD安德森癌症中心的Roy-Chowdhuri和Stewart介绍了肺病理学会关于肺部生物标志物测试的观点⁷。该学会重申了细胞学标本在肺部生物标志物检测中的作用，这方面最有力的病例用于EGFR突变检测和ALK易位检测。在最近FDA批准靶向抑制剂克唑替尼的背景下提到了ROS1。其他基因，如BRAF，ERBB2，MET和RET以及鳞状细胞癌靶向FGFR1，PDGFRA和PIK3CA被列为肺部应用的研究。EGFR突变特异性IHC可以应用于细胞性非常低的样本，其中PCR可以是阴性的，否则的话，由于其低阴性预测值，这种测试的效用就很有限。ALK FISH测试可以在细胞学标本上进行，并使用经过适当验证的方案。值得注意的是，FDA批准ALK时没有明确说明细胞块FISH测试作为伴随诊断测试，但如果没有合适的活检材料，则经常使用细胞块。ALK IHC可与细胞学标本一起使用，作为FISH的相对快速且廉价的替代品。逆转录PCR虽然传统上不推荐，因为它只能检测到一些研究得很好的融合伴侣，但可用于细胞性有限的细胞学标本。多种细胞学标本制剂已成功用于含有多个基因靶标的新一代测序肺突变板。尽管NGS组通常使用相对较高的DNA输入量，但非福尔马林固定的细胞学标本通常具有比FFPE组织更高质量的DNA，因此只需较低阈值的DNA输入就足以用于测试。（参见「下面的组织提取」）

参考文献：

1. Aisner DL, Rumery MD, Merrick DT, et al. Do more with less: tips and techniques for maximizing small biopsy and cytology specimens for molecular and ancillary testing: the University of  Colorado experience. Arch Pathol Lab Med.2016;140(11):1206–1220.

2. Tian SK, Killian JK, Rekhtman N, et al. Optimizing workflows and processing of cytologic samples for comprehensive analysis by next-generation sequencing: Memorial Sloan Kettering Cancer Center experience. Arch Pathol Lab Med.2016;140(11):1200–1205.

3. Saqi A. The state of cell blocks and ancillary testing: past, present, and future. Arch Pathol Lab Med. 2016;140(12):1318–1322.

4. Zhang M, Lin O. Molecular testing of thyroid nodules: a review of current available tests for fine-needle aspiration specimens. Arch Pathol Lab Med. 2016;140(12):1338–1344.

5. Zhou F, Moreira AL. Lung carcinoma predictive biomarker testing by immunoperoxidase stains in cytology and small biopsy specimens: advantages and limitations. Arch Pathol Lab Med. 2016;140(12):1331–1337.

6. Savic S, Bubendorf L. Common fluorescence in situ hybridization applications in cytology. Arch Pathol Lab Med.2016;140(12):1323–1330.

7. Roy-Chowdhuri S, Stewart J. Preanalytic variables in cytology: lessons learned from next-generation sequencing—the MD Anderson experience. Arch Pathol Lab Med. 2016;140(11):1191–1199.

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