独家专访 | 联手蓝鸟，华人团队改进病毒载体生产过程，提升大规模生产效率和可靠性

基于病毒载体的基因疗法成为许多先天性和获得性疾病最先进的治疗方法之一，具有代表性的病毒载体包括腺病毒相关载体（Adeno-associated viral vectors, AAV）和慢病毒载体（Lentiviral vectors, LVV）。随着 7 款以病毒载体为基础的基因疗法获得批准，全球范围内，有接近 1000 个以美国和中国为首的临床试验正在进行。

市场对于病毒载体的需求呈爆发式增长。在国内，CRO/CDMO 公司和元生物从 2018 年至 2020 年，营业收入从 4420.97 万元上升至 14276.91 万元，年均复合增长 79.70%。CDMO 公司派真生物则凭借着 AAV 的生产，已服务 200 + 家海内外知名基因治疗药企及科研院校，服务范围遍布 15 个国家地区。

然而，业内依旧公认：病毒载体的大规模生产仍面临典型的挑战，包括可扩展性、量产、整体缺乏稳定性等。

近日，美国约翰斯霍普金斯大学材料系及生物医学工程系教授、纳米生物技术研究所副所长毛海泉博士在 Nano Letters 上发文表示，开发了一种提高慢病毒载体大规模生产效率和可靠性的纳米技术，称提高了病毒载体生产的可靠性、重复性以及产量。

目前，毛海泉团队就该技术和蓝鸟建立合作，将共同开发下一代大规模纳米转染技术，双方已经在进行临床规模的放大实验和生产流程优化。

对此，生辉也联系到了毛海泉及本文第一作者胡一宗博士，就这项研究进行了探讨。

大规模生产、尺寸可控

以研发为目的的小规模慢病毒载体生产多采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统（Cell Factories, Cell Stacks）的贴壁细胞。由质粒 DNA  (pDNA) 和聚乙烯亚胺（PEI）组装的复合颗粒已被广泛用于生产基因治疗的慢病毒载体 。但当转向临床实验时，则需要大量的慢病毒载体，生产工艺放大就极为重要。

其核心步骤之一是使用质粒 DNA 转染在生物反应器内大规模培养的细胞，让它们作为 “工厂” 在细胞内生产病毒载体的各个部分，随后进一步组装、纯化。

“此步骤不仅需要繁琐的溶液准备和混合过程，还涉及严格的操作时间控制，在工艺重复性和可靠性上有显著局限，不便于放大生产；同时，业界对于决定转染步骤效率的因素缺乏认知，导致病毒载体的产能提升缓慢，且普遍缺乏产量对投料量的递增相关性。这样的生产工艺满足目前的临床需求已经初现紧张，且无形中提高了成本，势必限制病毒载体基因治疗领域在未来的长远发展。” 胡一宗说道。

尽管 pDNA/PEI 纳米颗粒已经被广泛用于转染各种类型的细胞，但现有的方式组装的颗粒大小为 30-200nm，几乎没有报道过颗粒直径超过 200nm 的颗粒的转染活性。

基于此，该研究团队设计了一种可扩展的方法，通过颗粒表面电荷的可逆调整，通过自下而上的组装策略生产 60 到 1000 nm 之间任意尺寸的 pDNA/PEI 颗粒。

图 |  pDNA/PEI 颗粒的大小决定了它们在慢病毒载体生产细胞中的转染效率（来源：上述论文）

根据胡一宗的介绍，团队从先前该体系的动力学组装原理的研究结论出发，首先判断 400-500nm 大小的纳米颗粒可能需要上千条 DNA 进行组装，从而否定了通过一步法直接合成的可能性。

然后，基于对该体系动力学稳定性的理解，团队研究者开发了一种自底向上的方法，即首先合成尺寸在 50 纳米左右的、由单个 DNA 组成的、由表面互斥电性稳定的 DNA-PEI 纳米颗粒作为单元物，接着通过提高溶液碱性和增加离子强度降低互斥电荷密度，从而可控地操纵单元物相互融合。当尺寸生长至目标区域时将溶液条件逆转，纳米颗粒重新在该尺寸由表面互斥电性稳定。

“我们的研究表明 pDNA/PEI 颗粒的大小是高转染效率的关键决定因素，最佳大小为 400-500 nm。这也是由细胞摄取相关机制所决定。这种颗粒制造方法有效地简化了病毒制造过程，提高了生产质量和一致性。”

尽管 pDNA/PEI 复合纳米颗粒不是新型材料，很多公司都用来生产病毒载体。但胡一宗直言，仍旧存在无法使纳米颗粒稳定的问题，这些公司也并不清楚是什么性质决定转染和生产效率。“我们发现了纳米颗粒的尺寸是决定性因素，并且可以做到大规模生产尺寸控制的、高效的颗粒。”

“通用性高，无产业化限制”

事实上，毛海泉团队和蓝鸟渊源已久。两年前在美国基因和细胞治疗协会的年会上，胡一宗展示了相关的研究，蓝鸟生物资深科学家 Nolan D. Sutherland 与之联系，并讨论了该技术及其在慢病毒载体生产中的应用。Sutherland 认为该团队的方法可能有助于简化转染，这是生产病毒载体的关键步骤。

在本次研究的后续验证中，团队将纳米颗粒在实验室生产后冷冻，经低温运送至蓝鸟公司，直接在反应器内进行慢病毒载体生产试验。

结果表明，这些纳米颗粒在低温下可以储存至少 4 个月而保持稳定；融化后的纳米颗粒完全保留了其生产尺寸和浓度，且可在数小时内在室温下保持稳定。这使生产流程不再需要严格的投药时间控制，极大地简化了生产操作。同时，在中试规模的反应器内，这些稳定的纳米颗粒相较于该公司标准生产流程的最佳对照，提高了慢病毒载体的产量。

图 | 控制大小的 pDNA/PEI 颗粒的放大生产，并验证生物反应器中 LVV 生产的转染效率（来源：上述论文）

对于该结果，Sutherland 也十分欣赏，“随着对基于慢病毒载体的细胞治疗产品的需求急剧增加…… 这项新技术将大大提高我们治疗性 LVV 的生产质量、一致性和产量。” 目前，双方已经在进行临床规模的放大实验和生产流程优化。

提及该技术产业化潜力时，毛海泉表示，“团队特地选择了一款通用的包裹核酸的材料，转化可能性更高，也可以用于其它材料。且由于在试验中已经放大到公升级了，对于大规模推向产业化基本无限制。"

胡一宗也补充道，“由于病毒载体生产是用于体外规模培养的细胞的，不存在安全性问题，DNA/PEI 转染生物反应器内的细胞后，最终是把这些细胞全部裂解提纯病毒载体，也不会残留 PEI。”

面对业内普遍存在的病毒载体规模化量产的难题，毛海泉也表示，这项技术也可以考虑推广给其它基因治疗公司。并称在了解国内转让立项的前提下，也会考虑创办公司。

“产量翻倍，成本可降低 2 倍”

“病毒载体基因治疗的主要挑战之一是如何提高制造的病毒载体的质量、纯度和成本，以便我们可以使用尽可能小的有效剂量，减少免疫副作用，并降低治疗成本。” 毛海泉表示。

“如果产量可以翻倍，那么成本就有可能降低 2 倍。”Catalent 细胞和基因治疗业务部产品开发全球负责人 Thomas VanCott 博士表示， Catalent 是最早生产 AAV 载体的工厂之一，也是第一个获得 FDA 许可的提供基因治疗产品的 CDMO。

对于上述提到的可扩展性、稳定性和量产等问题，除了毛海泉团队外，业内也有不同的见解。

对于基因治疗，递送载体一般为 AAV、腺病毒和慢病毒。如果要有效地生产，制造商们需要合适的细胞系。

“理想情况下，应该使用稳定的细胞系来最小化批次间的差异。但是，由于病毒基因在整合到细胞基因组中时具有一些固有的毒性，因此细胞系的产生和维持非常棘手。”Vigene Biosciences 首席商务官 Jeffrey Hung 博士说，该公司已经开发了哺乳动物和昆虫细胞系，用于悬浮或贴壁培养中的病毒生产。

CDMO 公司 Thermo Fisher 对此也赞同，该公司已经开发了 CTS 病毒生产细胞 ，用于在悬浮 HEK293 细胞中生产可扩展的高滴度慢病毒。对于基因治疗公司而言，以 Thermo Fisher 为代表的 CDMO 无疑是不二选择，这类公司通常拥有工业规模基因治疗工作流程的经验，可以提供可靠高效的生产流程。

然而，国外能够提供 AAV 病毒生产的 CDMO 公司，且能够为处于 IND 阶段较为成熟的项目提供完整服务的公司不超过 20 个。

图 | Thermo Fisher Scientific 已开发出多种用于病毒生产的细胞系

除此之外，病毒载体生产过程优化也至关重要。上游科学家必须应对多种培养和转染参数，而下游科学家必须应对缺乏适用于所有载体、血清型和表达系统的标准平台。科学家们面临着一些非常具体的挑战，例如分离空的和完整的 AAV 衣壳，以及需要为每种血清型调整下游生物过程。

Sartorius 公司则在这方面拥有话语权，该公司有一个可以优化的平台，可以快速纯化所有 AAV 血清型，并实现有效的空 / 全衣壳分离。据悉，该平台不依赖于 AAV 亲和力测定，而是利用正交化学的组合来达到所需的纯度和产量水平。

MilliporeSigma 则采取了一种综合方法来满足更高效病毒载体的生产需求，该公司创建了 VirusExpress 慢病毒生产平台，它将高性能包装细胞系与化学成分确定的培养基和优化的悬浮工艺相结合，以增强上游操作的可扩展性。据悉，该公司最近投资 1.21 亿美元扩建了位于加利福尼亚州卡尔斯巴德的病毒载体制造 CDMO 设施，可容纳 1000 升一次性生物反应器，将于年底上线。

病毒载体生产也需要经历单细胞克隆阶段。克隆性与制造过程中的一个阶段有关，监管机构需要质量证据证明该过程已被简化为单个细胞，以最大限度地减少细胞库内的异质性以限制过程可变性。

Solentim 公司称其技术可用于确保细胞系生产的克隆性，并提高细胞生长的效率。该公司用户包括 GSK、Thermo Fisher 等。

可以看出，业内正在积极借鉴过去三十年生物制剂商业化的经验教训，不仅要面对载体生产的挑战，而且还要提前考虑满足商业规模和监管需求。

参考资料：

• The Next Generation of Cell Factories for Viral Vector Productionhttps://hub.jhu.edu/2021/07/15/projects-creates-better-viral-vectors-for-gene-therapy/

• https://engineering.jhu.edu/materials/faculty/hai-quan-mao/

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8283758/

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