Science | 蛋白质组学研究揭开应激颗粒解聚与泛素化的分子机制
当你压力特别大的时候，你会带上什么样的标签？比如说睡眠不足、双眼无神，像极了期末季正在“预习”功课的当代大学生们。但是当细胞被压力所胁迫的时候，又会带上什么样的标签呢？
细胞应对胁迫的时候会全面停止翻译过程，并选择性地开启一些应激响应因子的表达【1】。另外，细胞中其他的生物途径也会被关闭或者扰乱，其中包括核质运输、RNA剪接过程以及细胞周期相关的活动均会受到影响【2】。翻译抑制以及随后多种多聚体的分解会导致细胞质内无核糖体结合的mRNA浓度上升，最终导致名为应激颗粒（Stress granules）的细胞凝聚体的形成【3】。应激诱导的细胞变化促使细胞在短时间内获得适应性，但是胁迫消除之后应激颗粒的需要被逆转，从而恢复细胞内活动的正常进行并重建细胞内稳态环境。因此，在胁迫去之后，应激颗粒逐渐降解、翻译以及其他的生物学途径恢复正常，但是目前为止细胞在胁迫去除之后应激颗粒解聚的过程是如何被调控的还不得而知。
6月24日，霍华德休斯医学研究所St Jude儿童研究医院J. Paul Taylor研究组在Science发文，题为Ubiquitination is essential for recovery of cellular activities after heat shock，揭开了应激情况下泛素化在恢复细胞活性以及介导应激颗粒解聚过程中的具体机制。
之所以作者们会将目光集中于泛素化，是因为关于应激颗粒动态变化相关研究表明，类泛素化修饰SUMO可能会对应激颗粒的非常重要【4】；另外也有研究表明应激颗粒中包含的蛋白泛素化水平极低，说明泛素化的偶联对于应激颗粒的动力学变化是完全不必要的【5】。因此，在多方争论之中，作者们认为泛素化可能揭开应激颗粒解聚这一秘密的钥匙。
为了揭开这一问题的答案，作者们希望对人胚肾细胞（Human embryonic kidney，HEK）响应不同形式的应激胁迫过程中的反应进行检测，作者们分别将细胞暴露于热胁迫（42℃）、氧化胁迫（亚砷酸盐）、渗透压胁迫（山梨醇）、紫外胁迫（UV）以及蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）胁迫之下，并将未受胁迫的细胞作为对照，处理后分别进行串联泛素结合实体（Tandem ubiquitin binding entity，TUBE）从而捕捉泛素化组学（Ubiquitinome）的变化，并利用无标记的液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography with tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）的大规模蛋白质组学方法进行分析（图1）。
图1 TUBE方法的原理以及不同胁迫处理后对HEK293T细胞的泛素化组学变化的分析
通过对不同胁迫处理后的细胞中泛素化组学的大规模分析，作者们发现泛素化修饰的蛋白质组学变化依赖于不同的胁迫处理。比如某些蛋白质的泛素化修饰的变化只在热激处理或者是UV暴露的情况下出现。那么不同应激胁迫过程中出现的泛素化修饰变化的蛋白质组有什么特征呢？以热激胁迫处理为例，作者们对热激处理以及恢复过程中泛素化修饰的动力学变化特征进行检测。作者们使用不同的多聚泛素化抗体或者是不同修饰位点（K48或者K63）的多聚泛素化修饰抗体进行检测，发现热激处理以及恢复之后泛素化修饰并没有特别显著的位点或者链种类的特异性。另外，作者们还对不同的细胞热激处理之后的TUBE法泛素化组学变化进行分析，比如在诱导多能干细胞来源的神经元或者小鼠皮层神经元中，作者们发现热激处理以及恢复过程中泛素化组学变化没有太大的差异。因此，该结果说明应激胁迫处理导致的泛素化组学变化并没有太多的细胞特异性。
进一步地，作者们对热激胁迫过程中泛素化组学变化受到影响的蛋白的功能进行分类和分析，发现与先前的结果一致【2】：热激胁迫调节下，核质运输相关的因子招募进入应激颗粒而影响核质运输过程。另外通过基因本体论分析，作者们发现泛素化组学的变化还会出现在翻译以及代谢过程相关的一些蛋白中。但与亚砷酸盐诱发氧化胁迫相比，不同的应激类型还是会导致不同的泛素化修饰的变化模式。值得一提的是，热激泛素化学中发生变化的一大类是mRNA结合蛋白，该结果说明热激依赖的泛素化修饰可能会出现在一些信使核糖核蛋白（messenger ribonucleoprotein，mRNP）复合体的蛋白之中。泛素化出现在组装完全的复合体上而非其中某个单独的RNA结合蛋白之上（图2）。
进一步地，作者们想知道对于热激胁迫导致的泛素化变化对于应激颗粒的解聚是否具有一定的作用。通过免疫荧光染色，作者们发现多聚泛素化抗体会迅速地与热激处理后产生的应激颗粒产生共定位。另外Taylor实验室同期发表了另一篇Science论文，研究发现应激颗粒关键调节因子G3BP1的泛素化对于细胞应激颗粒从热激处理恢复后的解聚非常关键。作者们发现，在对热激处理的细胞进行一定浓度的泛素化抑制剂的暴露会导致热激处理恢复后应激颗粒的解聚出现问题（图3）。因此，该结果说明泛素化对于细胞从热激处理后恢复正常的生物活性、促进应激颗粒的解聚非常关键。
图3 泛素化抑制剂处理后会抑制应激颗粒的解聚
为了进一步证明泛素化修饰在细胞解除胁迫后恢复正常生物学活性中的作用，作者们希望通过对于泛素化修饰对于胁迫影响核质运输过程进行检测。为此，作者们构建了一种可以进行核质穿梭的报告因子系统（Shuttle-tdTomato nucleocytoplasmic reporter assay）【2】，该系统将荧光蛋白与核定位信号（Nuclear localization signal）与核运出信号（Nuclear export signal）相融合。作者们发现细胞在进行泛素化抑制剂处理后核质穿梭运输的能力在胁迫解除之后仍然受损，因此泛素化水平对于热激胁迫之后核质运输功能的恢复非常关键。
图4 工作模型
总的来说，该工作发现热应激诱导一系列特定蛋白的靶向泛素化，而这种泛素化修饰是细胞从多种热应激诱导的细胞胁迫中恢复所必需的，其中包括mRNP重构的逆转、应激颗粒的解聚、核质运输功能以及蛋白质合成的恢复（图4）。该工作建立了新颖的泛素化组学的鉴定方法，揭开了泛素化修饰在细胞响应不同胁迫过程中大规模蛋白质组学的变化。
参考文献
1 Harding, H. P. et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular cell 11, 619-633, doi:10.1016/s1097-2765(03)00105-9 (2003).
2 Zhang, K. et al. Stress Granule Assembly Disrupts Nucleocytoplasmic Transport. Cell 173, 958-971.e917, doi:10.1016/j.cell.2018.03.025 (2018).
3 Balagopal, V. & Parker, R. Polysomes, P bodies and stress granules: states and fates of eukaryotic mRNAs. Current opinion in cell biology 21, 403-408, doi:10.1016/j.ceb.2009.03.005 (2009).
4 Keiten-Schmitz, J. et al. The Nuclear SUMO-Targeted Ubiquitin Quality Control Network Regulates the Dynamics of Cytoplasmic Stress Granules. Molecular cell 79, 54-67.e57, doi:10.1016/j.molcel.2020.05.017 (2020).
5 Markmiller, S. et al. Active Protein Neddylation or Ubiquitylation Is Dispensable for Stress Granule Dynamics. Cell reports 27, 1356-1363.e1353, doi:10.1016/j.celrep.2019.04.015 (2019).