新冠检测假阳性突发式增多，从发现到清除全过程
前 言
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新型β属冠状病毒,属于单链RNA病毒,是引起新型冠状病毒肺炎（COVID-19）主要病原微生物[1]。
实时荧光RT-PCR作为SARS-CoV-2确诊病例的诊断标准之一，是疫情其中主要的实验室检测手段[2-3]，在疫情防控中起到非常重要的作用，但同时也暴露了众多新冠冠状病毒核酸实验室的短板与不足。
本案例旨在通过新型冠状病毒核酸实验室假阳性增多的分析处理，为病原微生物安全防护提供建设性意见。
案例经过及分析
根据SARS-CoV-2检测实验室工作人员反映，2020年6月20日至2020年6月23日期间SARS-CoV-2核酸检测假阳性结果增多，主要表现形式为：阴性对照样品出现扩增曲线（图1-2）；假阳性样品突发式增多伴随阳性孔位不确定性（图3-4）。
图1：阴性对照样品出现扩增曲线
检测日期：2020年6月20日
图2：阴性对照样品出现扩增曲线
检测日期：2020年6月21日
图3：假阳性样品突发式增多，伴随阳性孔位不确定性
检测日期：2020年6月20日
图4：假阳性样品突发式增多，伴随阳性孔位不确定性
检测日期：2020年6月21日
2020年6月23日，SARS-CoV-2核酸检测实验室召开紧急会议，询查实验室工作人员近期检测流程情况，并跟踪了当天第一批SARS-CoV-2检测全过程，并没发现违反检测流程的现象，会议决定对SARS-CoV-2核酸检测实验室的环境监测点进行SARS-CoV-2核酸检测分析。
采样方法为：
实验活动与环境消毒前，使用病毒采样拭子蘸取H3-1采样液，对实验室操作台面、移液器表面及吸嘴部分、储存冰箱及传递窗把手、核酸提取仪表面、荧光定量基因扩增仪扩增仓、生物安全柜内壁反复涂抹，然后采样拭子回收洗脱至H3-1采样管；
空气监测则使用空气沉降法，H3-1采样管开盖使采样液暴露于固定监测位置（<30 m2放置3个点，>30 m2放置5个点）30 Min。
检测结果如表1。
表1 核酸检测实验室环境监测点SARS-CoV-2核酸检测结果[N(%)]
根据上述新冠核酸实验室环境监测点SARS-CoV-2核酸检测结果判断，试剂准备区与标本制备处理区所有环境监测点SARS-CoV-2核酸检测结果阴性，而扩增及产物分析一区环境监测点均出现SARS-CoV-2核酸检测结果阳性，那么是实验室污染了吗？如果是又属于什么类型污染呢？污染源来自哪里？如何清除污染源？
实时荧光RT-PCR作为高灵敏度的检测手段，极其微量的样品或者污染物也能扩增检出，即在本不该出现荧光信号的阴性样本、阴性对照（生理盐水）或空白对照中出现了阳性的荧光信号（扩增曲线），出现假阳性结果而误导临床诊断或者浪费试剂耗材。
新冠核酸实验室污染的表现多为：假阳性的渐进式、散发式、突发式增多，同时更多的案例表现为阴性对照出现阳性荧光信号（扩增曲线），因此该新冠核酸实验室极大可能已被污染。
据报道目前核酸实验室污染的主要类型有：①标本污染；②试剂污染；③扩增产物污染；④设备污染；⑤其他污染[4]。
标本污染主要是容器被污染、容器密封不严造成样品被污染等；
试剂污染主要是在体系试剂配制加样过程中，由于加样器、容器、双蒸水、阴性对照及其它试剂被PCR核酸模板或阳性对照污染；
扩增产物污染主要是PCR实验室中最主要、最常见的污染。扩增产物拷贝量大，极其微量的泄露就可以引起假阳性结果的产生，其形成气溶胶含长短不一核酸片段小颗粒，沉降到操作台面、扩增仪等物体及空气中造成扩增及产物分析区或者实验室大面积的污染；
设备污染主要是仪器接触了PCR核酸模板、阳性对照、扩增产物未清除或无法清除造成的污染，其往往表现为特定的孔位假阳性，同一区域的其他环境监测点（如：操作台面、空气等）多为阴性结果；
其他污染主要是不明污染原因的污染，因此该新冠核酸实验室可能为扩增产物污染污染。
根据扩增及产物分析一区环境监测点的SARS-CoV-2核酸检测结果，PA7600荧光定量基因扩增仪扩增仓阳性比率最高，推断可能为PCR管爆管或者盖子未压紧而引起扩增产物污染。
因此检查了PA7600荧光定量基因扩增仪扩增后的PCR管（独立装），发现某厂商某批部分PCR管加盖后，在重复高温变性、低温退火和延伸三个循环中盖子变形、崩盖（质量问题）而引起扩增产物泄露污染（图5）。
图5：部分独立PCR管扩增后盖子变形、崩盖（质量问题）
当天实验室生物安全领导小组召开紧急会议并上报了分管领导、医院生物安全管理委员会、医院感控科等部门，对核酸实验室污染进行了评估，确定了污染源清除方法和启动了应急预案。
SARS-CoV-2核酸检测每批次实验结束后严格按以下消毒顺序进行为期7天的清洁消毒。
①清洗空调过滤网；
②75%酒精对污染区域空气进行喷雾（确保安全的前题下）；
③使用PCR Cleaner对扩增及产物分析一区仪器设备（如基因扩增仪扩增仓与外表等）擦拭；
④新鲜配制1000 mg/L有效氯84消毒液分别擦拭工作台面、冰箱和传递窗把手；
⑤作用10min后用清水擦拭上述仪器设备及工作台面等物表；
⑥新鲜配制1000 mg/L有效氯84消毒液拖擦地面，打开实验室紫外灯照射≥1h[4-5]；
⑦保持开窗通风排气。
封闭管理污染区域，使用污染源清除方法清洁消毒扩增及产物分析一区，启用备用实验用房（扩增及产物分析二区）和仪器设备(如图6-9)。
图6：启用备用实验用房（扩增及产物分析二区）
图7：启用荧光定量基因扩增仪及配套实验室试剂及耗材（如八联管等）
为后期SARS-CoV-2污染源清除验证和临床标本检测的正常运行提供了可靠的保障。
图8：荧光定量基因扩增仪正常运行
图9：荧光定量基因扩增仪阴阳性对照通过
按照污染源清除方法对扩增及产物分析一区实行7天清洁消毒去污染源后，对该区域的操作台面、荧光定量基因扩增仪扩增仓、空气等环境监测点连续3天SARS-CoV-2核酸监测，连续3天检测SARS-CoV-2核酸阴性，判定为污染源清除成功，实验室可正常使用运行（图10-12）。
图10：操作台面（14号样品）、荧光定量基因扩增仪扩增仓（15号样品）、空气（16号样品）SARS-CoV-2核酸阴性
检测日期：2020年6月29日
图11：操作台面（201号样品）、荧光定量基因扩增仪扩增仓（202号样品）、空气（203号样品）SARS-CoV-2核酸阴性
检测日期：2020年6月30日
图12：操作台面（201号样品）、荧光定量基因扩增仪扩增仓（202号样品）、空气（203号样品）SARS-CoV-2核酸阴性
检测日期：2020年7月1日
通过本次的案例，暴露了我们SARS-CoV-2核酸检测实验室的问题，SARS-CoV-2核酸检测不单要注重生物安全的防护，更要注意预防核酸实验室的污染，一旦实验室污染将对群众身体健康、环境、医院医疗体系运行、疫情防控形势、医院经济及社会效益生产十分消极的影响，因此实验室生物安全领导小组督促SARS-CoV-2核酸检测实验室迅速自查并进行以下下整改：
图13：完善了医学检验科质量管理体系文件（质量手册、程序文件、作业指导书、制度、生物安全评估等）
图14：对实验室生物安全进行评估
图15：加强实验室的生物安全管理
图16：严格按照基因扩增实验室质量体系文件规范新冠核酸检测流程
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图17：强化防护服穿脱
图18：医务科、院染科对考核进行评分
图19：防护服穿脱考核
图20：防护服穿脱考核
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图21：对检验流程进行全程考核
图22：核酸实验室人员对5个考核样品进行上机操作
图23：重点强调八联管在放进和取出扩增仓时注意检查八联管盖子是否盖紧！八联管是否垂直固定放置，八联管盖子有无油渍、干粉等污染物。
图24：重点强调八联管在放进和取出扩增仓时注意检查八联管盖子是否盖紧！八联管内液面是否同一直线！确保加样的准确性，严防或者及时发现扩增产物因爆管引起实验室污染（本次实验室污染案例的“凶手”）。
图25：对核酸检测实验室人家进行应急预案培训
图26：演练在SARS-CoV-2核酸检测过程中实验人员休克等突发状况的应急处理
图27：加强医疗垃圾处置工作人员的生物安全培训
图28：要求实验室结束后将扩增八联管装密封袋处理。预防扩增产物泄露污染
铺料质检是SARS-CoV-2核酸检测质量控制中我们往往忽视的环节，本次实验室扩增生物的污染最根本的原因是我们对试验辅料质检的不重视，未能及时发现PCR管的质量问题，从而导致实验室污染。
核酸检测实验室的辅料指的是核酸常用的一些辅助试剂和耗材，例如采样管、拭子、离心管、PCR管、吸头、移液器、无核酸酶水和试管架等。铺料质检一般包括外包装检查、内包装检查、性能质检、污染物质检、抑制物质检等。
下面以本次案例中的PCR管（八联管）为例，介绍一下常见的铺料质检。
①渗漏密闭性：将n个PCR管（八联管）加入半量墨汁，盖好盖子后放入水中，浸泡30min，没有墨汁渗出为合格。
②离心密闭性：将n个PCR管（八联管）加入半量纯水，放入离心机，1000rpm，30min，管盖未崩开未漏液为合格。
③热密闭性：将n个PCR管（八联管）加入半量纯水，盖好盖子称重后放入PCR仪，设置一个常用的PCR程序，程序运行完毕后，再进行称重，PCR管未变形，管盖未崩开未漏液，前后重量未变化为合格。
④冷密闭性：将n个PCR管（八联管）加入半量纯水，放入-20℃冰箱，24h，离心管未变形，管盖未崩开未漏液为合格。
⑤污染物质检：将n个PCR管（八联管）加入半量阴性纯水，盖好盖子涡旋1min后静置5min，作为模板进行扩增，RT-PCR无扩增为合格。
⑥抑制物质检：将n个PCR管（八联管）分别加入弱阳性质控物,室温静置5min，然后进行提取;RNA核酸，DNA核酸，室温静置5min，作为模板进行扩增，RT-PCR扩增未被抑制为合格。
⑦空白荧光通透性：对于RT-PCR,需要考察PCR管是否有非特异性荧光信号，将n个空PCR管，盖好盖子后放入PCR仪，设置一个常用的PCR程序，程序运行完毕后，RT-PCR无扩增为合格。
⑧阳性荧光通透性：对于RT-PCR,还需要考察PCR管是否会抑制荧光的通透性，将n个含弱阳性样品和扩增试剂的PCR管，与确认无荧光干扰的PCR管，盖好盖子后放入PCR仪一同扩增，设置一个常用的PCR程序，程序运行完毕后，RT-PCR扩增未被抑制为合格。
总 结
本次实验室SARS-CoV-2核酸检测实验室扩增及产物分析一区产物污染，采取了有效的环境监测检测手段及污染源清除方法，迅速有效启动了应急预案。
从发现到清除污染源仅用了10天，完成了一次生物安全防护的大考核，但同时也暴露了实验室SARS-CoV-2核酸检测实验室预防扩增产物污染意识淡薄，PCR管或八联管使用不规范，实验室铺料无质检等问题。
因此建立完善的实验室质量管理体系及实验室铺料质检制度（措施）、培养实验室技术人员应急处理能力和生物安全意识极其重要。
COVID-19为当下新发疫情，SARS-CoV-2核酸检测也是应对疫情有效诊断标准，生物安全防护和预防实验室污染极其重要，笔者通过该案例阐述了核酸实验室环境监测检测、应急预案、完善的实验室质量管理体系的重要性，建议对SARS-CoV-2核酸检测实验室铺料质检是一大亮点，值得推广。
李轶春，副主任技师，从事临床微生物检验26年，现任北海市中医医院检验科主任，中国中西医结合学会检验医学专业委员会分子诊断学术委员会委员，广西医师协会第一届检验医师分会中青年委员会常务委员，广西抗癌协会常务委员，广西医学会微生物学与免疫学第五届委员会常务委员等职务
【参考文献】
[1]LIQ,GUANX,WUP,etal.EarlyTransmission Dynamics in Wuhan,China,of novel coronavirus-infectedpneumonia[J/OL].NEJM,(2020-01-29)[2020-02-24].https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2001316.
[2]国家卫生健康委办公厅,国家中医药管理局办公室.新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第版)[EB/OL].(2020-03-04)[2020-04-20].http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7653p/202003/46c9294a7dfe4cef80dc7f5912eb1989.shtml.
[3]胡孝林,张亮亮,罗阳.新型冠状病毒肺炎实验室检测策略[J/OL].中华医院感染学杂志1-8[2020-07-23].httpkns.cnki.netkcmsdetail11.3456.R.20200430.1559.004.html.
[4]毕承恩,瞿文金,郑丽娟,等.核酸实验室污染原因及处理[J].临床血液学杂志(输血与检验),2017,30(01)135-137.
[5]薛秀荣,来祝檩,韩惠云.浅谈核酸检测实验室防污染措施[J].中国卫生产业，2018，15,（26）144-145.
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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼