新冠病毒的传播几乎已经遍布全世界，已经有215个国家和地区有确诊病例。很多国家都开始对过去保存的旧样品进行测试，试图追溯新冠病毒到底是什么时候开始出现在本地的。今天我们就总结一下这些发现，以及每个发现到底意味着什么。西雅图（华盛顿州）的发现来自于Seattle flu project （西雅图流感计划）[1]。这个研究计划始于2018年，最初意在收集有流感症状的西雅图地区居民的鼻拭子样本，进行检测分析，从而更详尽地了解流感病毒的传播方式。因此，这一计划保存了很多西雅图地区有急性呼吸道感染的人的鼻拭子样本。这些人中一部分有流感样疾病，如果是新冠病毒感染，也会因为症状符合条件被采样。2月底，西雅图新冠肺炎暴发以后，参与西雅图流感计划的研究人员回去检测了以前冻存的样本里是不是有新冠病毒。在2020年1月份收集的3600个样本里面0个是新冠病毒。此外，2019年10月到2020年2月的样本里面有各种各样的病毒，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、间质肺病毒和普通的季节性冠状病毒 (包括4种：229E、NL63、OC43和HKU1)。引起普通感冒最多的病毒是鼻病毒 (rhinovirus)，而排在第二位的就是普通的季节性冠状病毒（约占所有感冒的15-30％）。普通的冠状病毒在核酸检测法中很容易与新冠病毒区分开，没有混淆的可能性，这个发现还是很严谨的。2020年4月21日，美国加州宣布通过“开棺验尸”发现了一个2月初新冠病毒死亡的病例。死者是美国加州硅谷的一位57岁女性，名叫帕特里夏·多德（Patricia Dowd）。多德在一家跨国半导体公司工作，公司在世界各地都设有办事处。她作为审计师，需要接触来自世界各地的员工，并经常需要出差。2019年11月，她曾去北京出差。2020年2月2日，多德出现流感症状。四天后 （2月6日），她仍然觉得不舒服，在家工作。等到她女儿回家后，发现她倒在厨房的早餐吧台边，已经死亡。多德的流感测试为阴性，尸检发现似乎是严重的心脏病发致死，但是什么原因导致的并不清楚[2]。新冠肺炎在加州暴发以后，她居住的加州圣克拉拉县 (Santa Clara) 的卫生官员决定，重新调查该县十多例原因不明的死亡。3月中旬，多德的冻存组织样本被送到亚特兰大的CDC进行进一步检查，4月21日核酸检测结果公布，证实她感染了新冠病毒。美国CDC的科学家们正试图对分离的病毒RNA进行测序，与已经共享的序列进行比较，分析和其他病例的潜在联系。怎样用测序大法来进行流调，在以前的一篇日记里介绍过 （《117疫情观察：详解病毒基因序列追踪流调大法 | 史隽·Ⅶ》）。可惜，从死亡组织里分离出的病毒RNA，要测序不是件容易的事。全基因组测序对RNA的质量要求比较高，需要较长的、几乎没有断裂的RNA。到目前为止，CDC的科学家们仅获得了相对较短的RNA，虽然用来做RT-PCR确诊足够了，但还不足以用来做全基因组测序。此外，圣塔克拉拉县2月17日和3月6日发生的两例死亡事件，早先认为没有关联，现在也被确认与新冠病毒有关。这比之前加州公布的首例社区传播病例（2月26日）更提前了。新冠病毒的潜伏期长达14天，在出现症状之前，就已经可能具有传染性。多德在2月6日死亡之前已经病了几天，所以她很可能最早在一月份就将病毒传染给了其他人。2020年4月，加州州长加文·纽瑟姆（Gavin Newsom）宣布，一些地区的研究人员正在追溯2019年12月的验尸和尸检报告，看是否有更早的新冠病毒感染致死的病例。2020年4月30日，美国新泽西州贝尔维尔市的市长提出了一个令人震惊但未经证实的说法，说自己在2019年11月就感染了新冠病毒[3]。市长迈克尔·梅勒姆（Michael Melham）说，在最近的常规体检几天后，他要求家庭医生检查血液中是否存在新冠病毒抗体。4月29日，他得到了肯定的结果：他血液里检测到了IgG亚型的新冠抗体。他回忆自己4个月前在大西洋城参加新泽西市政联盟会议时生病了。2019年11月21日开完会回到家后，症状恶化，发烧到38.9°C，身上发冷，出现幻觉和喉咙痛，但没有新冠肺炎常见的呼吸急促或困难。他电话咨询了医生，医生诊断为严重的流感。然而，梅勒姆“认为”那时候他应该是感染了新冠肺炎。梅勒姆一个人住，除了1月下旬曾去过波多黎各的旅行外，最近几个月都没有旅行。他也没有打流感疫苗。然而，除了梅勒姆自己的陈述，新泽西州的卫生官员并没有确认他说的是否属实。他的家庭医生不知道使用的是哪个厂家的抗体试剂盒。市面上很多抗体试剂盒的准确率很低，有些甚至会和引起普通季节性感冒的冠状病毒反应，得出阳性结果。前一段时间，瑞士罗氏 (Roche) 制药公司的CEO就公开批评市面上充斥了许多不靠谱的新冠抗体试剂盒，这些试剂盒的假阳性和假阴性率都非常高。他认为这些试剂盒：一文不值（These tests are not worth anything, or have very little use）有些公司很没有职业道德地推出了（不靠谱的）产品（Some of these companies, I tell you, this is ethically very questionable to get out with this stuff,）任何非专业人员都可以做出一个抗体试剂盒……我们两个在车库里用一晚上时间就能做出一个来。（Every kind of amateur could produce an antibody test…The two of us could do it overnight in the garage.）
图1：路透社报道了罗氏CEO对市面上的抗体试剂盒的评价[4]。2) 即使他的抗体检测阳性结果是正确的，也无法确认他到底是什么时候感染的新冠病毒。11月份的生病很可能只是流感或者感冒，而真正的新冠感染反而是轻症或者无症状。抗体测试通常是检测两种类型的抗体：IgM和IgG。IgM抗体通常在感染后约一个星期内产生，这个时候患者可能还带毒。随后人体会产生另一种称为IgG的抗体，IgM水平会随之减弱。IgG抗体可以持续更长的时间，甚至感染过后，IgG抗体还会留在血液中一段时间。然而，新冠病毒 (SARS-CoV-2) 被人体清除后， IgM或IgG的抗体会在体内保留多长时间还不清楚。图2显示了SARS冠状病毒 (SARS-CoV-1) 的抗体在体内出现和存留的时间。这里要提醒大家，不同的病毒引起的免疫反应都会不同，图2只是一个参考。图3是根据目前发表的数据来预测新冠病毒的不同检测方法所适用的时间段。
图2：感染SARS病毒以后，产生的抗体在体内存留的时间[5]。
图3：新冠病毒感染前后，不同检测方法可能适用的时间段[6]。
1) 高灵敏度：可以检测各种各样识别不同病毒蛋白片段的IgM或IgG抗体。如果敏感度不高，就会造成假阴性。2) 高特异性：只检测到针对新冠病毒的抗体，排除针对别的病毒的抗体。这两点非常重要。抗体经常会有非特异性的识别，这就会造成假阳性结果。例如，引起普通感冒的季节性冠状病毒也在全球传播，如果一个抗体的灵敏度高而特异性低，就可能会识别出这些普通感冒病毒的抗体，导致假阳性结果。什么时候做抗体检测也很关键。刚感染病毒的患者，体内抗体还没有产生，结果就会是阴性。如果在恢复很长时间后检测，抗体浓度会随着时间的推移而降低，甚至消失，结果也可能是阴性。最后，每个人感染以后的反应不同，有些人产生抗体的能力不强。结果，一部分人虽然感染过病毒，却检测不到抗体。尽管市面上充斥了许多良莠不齐的新冠病毒抗体试剂盒，截至5月24日，美国FDA仅授权12种用于紧急使用。根据生产商提供给FDA的数据，不同试剂盒的敏感度 （88%到100%）和特异性 （90％到100％）的差别很大。好消息是，有两个敏感度和特异性都非常高的抗体试剂盒最近都被FDA紧急批准授权使用了：罗氏 (Roche) 和雅培 (Abbott) 公司的。一个第三方的实验室测试发现，雅培 (Abbott) 公司的抗体试剂盒的性能比公布的数据还要好一些 (图4)。期待这两个抗体试剂盒今后大量投入使用。
法国对冻存的呼吸道样本进行了回顾性分析，发现一名患者可能在2019年12月27日就感染了新冠病毒[8]。但也有人质疑这个样本是否被污染了。随着新冠肺炎在全球传播开，巴黎北部一家医院有个名叫伊夫·科恩（Yves Cohen）的医生和同事们决定，重新分析2019年12月2日至2020年1月16日期间诊断有类似流感症状的患者的124个样本。其中14个样本做了新冠病毒的核酸检测，里面有一个样本结果是阳性。这个样本来自于一位42岁的鱼贩子，名叫阿米鲁什·哈马尔（Amirouche Hammar）。2019年12月27日，哈马尔因为有胸痛和呼吸困难，前往这家医院就诊。医生诊断他患有病毒性肺炎，而且是一种未知的病毒，并使用了抗生素来治疗。但是当时医生们并没有进一步分析他到底感染的是什么病毒。哈马尔在生病之前没有旅行过，他的一个孩子在同一时间也有类似的症状。最终哈马尔的两个孩子都病了，而他的妻子却一直都没有生过病。哈马尔的妻子在当地的一家市场上卖鱼，医生们认为她可能是无症状的新冠病毒携带者，在市场上感染了这种病毒并传给了家人。科恩也提醒大家，这是一项回顾性研究，医疗记录并不详尽，可能缺少一些相关信息。诺丁汉大学 (University of Nottingham) 的分子病毒学教授乔纳森·鲍尔（Jonathan Ball）认为，不能排除这个样品在存储和测试的实验室中被污染的可能性。他认为如果这个病例是真的，那么法国新冠肺炎的暴发应该比现在看到的更早。3月底，米兰大学的流行病学和医学统计学教授阿德里亚诺·迪卡里（Adriano Decarli）说，2019年10月至12月期间，米兰和洛迪地区 (意大利新冠肺炎的震中) 因肺炎和流感住院的人数和往年相比有“显著”增加[9]。但到底有多少，他并没有具体的数字，只是感觉大约有几百人有类似流感的症状和肺炎，其中有些人已经死亡。因此迪卡里决定重新查看这些病例的就诊记录和其他临床细节，包括后来在家里死亡的人，以弄清意大利在2019年底是否已经开始传播新冠病毒。如果答案是“有”，需要进一步了解为什么此后相当长的一段时间内意大利的医生们没有意识到该病毒的存在。分析总结这类经验教训，可以让大家更清晰地认识这一全新的病毒，为应对可能出现的第二波暴发和以后的流行病传播提供借鉴。迪卡里说，他的研究结束后，根据结果，当地卫生部门可能会考虑对有疑似症状的死者进行“开棺验尸”。也有很多科学家认为，一月份之前欧洲不可能出现新冠病毒。英国东英吉利大学 (Britain’s University of East Anglia) 医学教授保罗·亨特就公开评论，除非意大利科学家分析以前存储的样本，找到了确实的证据，这种猜测没有什么可信度。考虑到新冠病毒感染以后有很大比例的人是无症状感染，如果这些有症状的病例真的是新冠肺炎 (COVID-19)，那整个欧洲早就应该暴发疫情了。意大利第一例确诊的新冠肺炎病例是在2020年2月21日，可是一些科学家认为，新冠病毒应该是在一月下旬开始在意大利传播的，但在一月份之前传播的可能性“非常低”。但是，这些都还只是猜测而已，没有任何确实的数据支持。如果有确实的数据证明早在11月，意大利就有新冠肺炎的确诊病例，这表明新冠病毒可能在一个社区默默传播好几个月都没有造成很多死亡，没有令人警觉，累积到一定程度后突然以极快的速度大规模暴发。那么另一个重要的问题也随之而来了：为什么新冠病毒在一个新的地区的早期传播会不为人注意？如果有大量的人死亡，死亡人数的统计会很明显。例如，图5是美国整体、纽约州、马萨诸塞州 （麻州）、加利福尼亚州 （加州）近几年因为任何原因造成的每周死亡人数的统计。2017-2019年死亡人数最多的都是1月，而今年是4月，疫情越严重的地方，超出历年平均值越多。
图5：美国2017-2020年每周死亡人数统计[10]。1) 5月5日，一位备注身份为“筑波大学博士”的日本医生（名叫福岛淳也）在Facebook上发表文章，声称在2019年8月的患者血清中发现了新冠病毒抗体。2) 5月15日，日本厚生劳动大臣加藤胜信在内阁会议后的记者会上表示，针对2019年1-3月份在关东和甲信越地区采集的500份无偿献血者的血样，检测机构用5个厂家生产的抗体试剂盒进行检测，其中两份样本新冠病毒抗体监测呈阳性。他也表示，不排除“假阳性”的可能[11]。第一个因为不是官方报道，也没有数据支持，暂且不论。第二个新闻，我找到了《朝日新闻》的原版报道[12]，看了一遍，故事其实是这样的：大家都听过两种新冠检测法：核酸检测和抗体检测。在感染后很短时间，核酸检测就可以检测到病毒的RNA。好的核酸检测非常敏感，例如德国的核酸试剂盒公布的数据，只要有5个核酸分子就能检测到[13]，因此核酸检测是用来诊断是否感染的经典方法。而前文说过，感染以后大约7天左右，人体才会产生抗体，抗体在病愈以后还会在体内存留一段时间，因此抗体检测不太适合诊断 (IgM可能可以检测到正在感染中的患者)，但是可以用来调查是否曾经被感染过。日本的人均核酸检测量比很多国家少得多，因此他们希望用抗体检测来掌握新冠病毒感染扩散的程度。
图6. 日本人均核酸检测量远少于德国、美国、新加坡、香港。数据来源：参考文献[14]
但是，在展开大规模的抗体测试之前，需要确保所用的抗体试剂盒是靠谱的。于是厚生劳动省4月下旬在东京和东北地区的 6个县抽取了1,000份献血样本，使用来自5家公司的抗体试剂盒进行检测。结果发现东京的500人中有3人（0.6％），东北6个县的500人中有2人（0.4％）为新冠抗体阳性。为了验证抗体试剂盒的准确度，用了2019年1-3月份,在关东和甲信越地区采集的500份无偿献血者的血样做对照组，因为理论上那个时候还没有新冠病毒。然而出乎意料的是，也有两个样本呈阳性。这个检测用的是15分钟就显示结果的快速检测试剂盒，目前也没有看到是哪个厂家生产的，试剂盒的性能指标如何。在抗体测试中，总是有一定比例的“假阳性”，例如，一个抗体试剂盒的特异性是90%的话，就可能得到这个结果。而且这次被调查的样本数量较少，因此，就像文章前面已经分析过的，结果还有待确认。日本已经决定进一步评估试剂盒的质量，扩大测试规模以掌握实际情况。随着越来越多的国家开始回顾性 “开棺验尸”，“新冠病毒是怎么在全世界传播开的”这个大谜团会越来越清楚。要注意的是，回顾性研究一样需要严谨的调研才能得出可靠的结论。“假阴性”“假阳性”和似是而非的猜测只会把水越搅越浑。最后备注一下，抗体生产商可以和下面这个联系，把自己的试剂盒送去给第三方检测一下，是骡子是马拉出来遛遛。好东西有第三方背书就更可信了，就像图4里Abbott的试剂盒。https://covidtestingproject.org/
这个项目的研究已经公布了第一批测试的一些抗体试剂盒的性能[15]。
[1] https://twitter.com/trvrb/status/1249414291297464321.
[2] https://www.nytimes.com/2020/04/22/us/santa-clara-county-coronavirus-death.html.
[3] https://www.nj.com/coronavirus/2020/04/nj-mayor-thinks-he-had-coronavirus-2-months-before-1st-confirmed-case-in-us.html.
[4] https://www.reuters.com/article/us-roche-results/a-disaster-roche-ceos-verdict-on-some-covid-19-antibody-tests-idUSKCN2240JS.
[5] P. C. Y. Woo et al., Longitudinal profile of immunoglobulin G (IgG), IgM, and IgA antibodies against the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus nucleocapsid protein in patients with pneumonia due to the SARS coronavirus. Clin Diagn Lab Immunol 11, 665-668 (2004).
[6] N. Sethuraman, S. S. Jeremiah, A. Ryo, Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA, (2020).
[7] https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance.
[8] A. Deslandes et al., SARS-CoV-2 was already spreading in France in late December 2019. International Journal of Antimicrobial Agents, 106006 (2020).
[9] https://www.reuters.com/article/us-health-coronavirus-italy-timing/italian-scientists-investigate-possible-earlier-emergence-of-coronavirus-idUSKBN21D2IG.
[10] https://www.cdc.gov/nchs/nvss/vsrr/covid19/excess_deaths.htm.
[11] http://m.cnwest.com/tianxia/a/2020/05/16/18753883.html.
[12] https://www.asahi.com/articles/ASN5H64VQN5HULBJ00C.html?ref=amp_login&_gl=1*n4tggv*_ga*UHR3Qm8xNmhDc1BBRmNuTW9kb2ZzUC1hX1o1cUwzTC0xZklvWWs3TnpqVUo2UmdQNHg0ajZKWldVRUJzTmpBbw..%E2%80%9D.
[13] V. M. Corman et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 25, 2000045 (2020).
[14] https://ourworldindata.org/coronavirus-testing.
[15] J. D. Whitman et al., Test performance evaluation of SARS-CoV-2 serological assays. medRxiv, 2020.2004.2025.20074856 (2020).
