科研 | 饮食、肠道菌群和结肠炎，复杂有趣的“三角关系”（第八期投票选出的文章）
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饮食和肠道菌群之间复杂的相互作用，尤其是这种相互作用如何影响肠粘膜炎症或炎症性肠道疾病的发展目前还不清楚。本研究在SPF小鼠和无菌小鼠中研究了40多种膳食成分、营养物质和肠道菌群的相互作用，并量化了膳食营养物质、肠道菌群对肠道健康和结肠炎发生的单独效应以及联合效应。
论文ID
原名：Interactions between diet and the intestinal microbiota alter intestinal permeability and colitis severity in mice
译名：饮食与肠道菌群的相互作用改变小鼠肠道通透性和结肠炎严重程度
期刊：Gastroenterology
IF：20.773
发表时间：2018年
通信作者：Dr. Jeremiah Faith
通信作者单位：西奈山伊坎医学院免疫学研究所，基因组学和多尺度生物学研究所
文章内容
引言
全肠内营养（EEN），即患者食用营养完全的简单饮食，是目前唯一经证实可治疗炎症性肠病（IBD），尤其是小儿克罗恩氏病（CD）的饮食方案。但理想的IBD饮食应该比EEN具有更好的效果，并应减少对饮食的限制从而提高患者依从性。饮食对IBD的影响可能涉及多种饮食成分、营养物质、宿主生理学、疾病异质性和肠道菌群之间的复杂相互作用，所以寻找理想的IBD饮食方案并不容易。
在总体稳定的前提下，肠道菌群的相对数量会随着饮食的变化而变化。小鼠和人类中，在改变饮食的24小时内，肠道菌群的数量就可以改变几个数量级，随后饮食保持不变时菌群就保持稳定。许多证据表明，肠道菌群在IBD中发挥重要作用，包括菌群构成与健康对照之间的差异、多种结肠炎动物模型中肠道菌群对疾病发生的必要作用，以及粪便菌群移植对溃疡性结肠炎（UC）治疗的影响。此外，饮食和肠道菌群可以通过代谢物和免疫相互作用共同影响宿主的生理。
为了解多种膳食成分、营养物质与肠道菌群之间的复杂相互作用，本研究采用了SPF和无菌（GF）动物结合超过40种膳食方案来量化营养物质对宿主生理以及实验性结肠炎的单独影响和协同影响。
1 确定影响结肠炎严重程度的饮食
我们首先对32种饮食，包含31种不同浓度和来源的单一营养物质进行筛选。以大豆蛋白、乳清、酪蛋白、蛋清为蛋白质来源，玉米油、橄榄油、猪油、等为脂肪来源，这些食物中蛋白质和脂肪的浓度范围（wt/wt）分别为5-41%和1-21%。将碳水化合物分成宿主可消化的碳水化合物，包括蔗糖、果糖、葡萄糖等，其浓度范围在24-83%之间，而那些宿主不可消化的（纤维），由纤维素、甲基纤维素、欧车前（Psyllium）等，浓度范围为5-15%。所有的饮食都不限制维生素或矿物质，每种营养素都在浓度范围内选择相差几倍的浓度进行研究。
将每种膳食组合随意喂养C56BL/6J SPF小鼠一周，然后在饮用水中加入3%的DSS诱导肠损伤和炎症（图1A）。在筛选期间，以诱导前4天内每只动物体重的平均水平为基线，以体重变化百分比为指标，连续7天检测疾病的严重程度。结果发现，经过饮食干预，疾病严重程度具有显著差别（P＜0.0001，ANOVA）。
随后，我们建立了诱导期间每只动物的体重减轻对于饮食营养物质浓度的函数。用逐步回归和lasso算法确定最能解释第4、7天体重减轻的营养素组合（图1B），结果发现，蛋白质摄入是体重下降增加的影响因素(p<0.001)，而纤维是体重下降减少的影响因素(p=1.9x10-14和p=9.5x10-9)或仅在第7天时（P＜0.0001）。
为了解各成分的具体作用，我们对31种不同营养素浓度进行回归分析（图1C）。结果发现，大多数蛋白质来源（酪蛋白，分离的大豆蛋白和乳清）加剧了体重减轻。为了明确推断，我们用不同来源（包括鸡肉和牛肉）的高蛋白（41%）和低蛋白（6%）重复上述研究。与筛选结果一样，高蛋白饮食小鼠的结肠炎严重程度增加(4天时，蛋清、鸡肉和牛肉对体重减轻作用的p值分别为0.0031、0.0072、0.0018)。在9种纤维来源中，只有欧车前、果胶和纤维素纤维与体重减轻有关，而甲基纤维素与更严重的疾病有关。
图 1
所有营养素中，酪蛋白与加剧体重减轻最相关，而欧车前纤维与最好的疾病预防作用相关。我们重点研究了高（41%，HC）和低酪蛋白（6%，LC）饮食，以及含有欧车前（5%，PSY）或纤维素（5%，CEL）的饮食。HC饮食的小鼠同时食用3 %的DSS，在第4天和第7天分别比LC饮食的小鼠减少了大约两倍的体重(d4时15.6%vs 8.2%，d7时35.8%vs 18.0%；p<0.0001；图2A)。HC相关的体重减轻与粪便脂蛋白-2浓度的增加(p=0.0035，图2C)、结肠外植体TNF-α和IL-6的增加(p=0.0003和p=0.0033，图2D-E)、更严重的结肠组织病理改变(p=0.0056，图2F，G)和结肠长度减少（P＝0.0003）相关。相比之下，PSY饮食的小鼠在第4天和第7天的体重减轻分别比CEL饮食的小鼠减少约9倍和2倍（d4时0.8%vs 7.2%，d7时14.2%vs 23.8%；p=0.010，p=0.011，图2B）。粪便脂蛋白-2（p=0.0013，图2C）、结肠外植体炎性细胞因子（TNF-α和IL-6；p=0.0077，p=0.0007，图2D-E）、结肠组织病理改变（p<0.0001，图2F-G）和结肠长度（p=0.0003）也有差异。这些结果证实，饮食蛋白质和纤维的变化是DSS小鼠结肠炎模型疾病结局的主要决定因素。
图 2
2 酪蛋白通过微生物依赖机制调节结肠炎的严重程度
为确定蛋白质对疾病的影响是否依赖于菌群，我们给GF和SPF动物提供HC或LC饮食。DSS结肠炎模型中，GF小鼠比SPF更易患疾病，因此我们在GF组中使用2%的DSS诱导产生相当于3%的DSS诱导SPF小鼠产生的疾病(图3)。结果发现LC饮食SPF小鼠在DSS干预后存活时间比HC饮食增加了1.8倍（4.4天-7.8天；图3A；p<0.0001），而两种饮食对GF小鼠存活时间的影响没有差异（5.6天-5.2天，p=0.22），这表明酪蛋白浓度对疾病的影响是菌群依赖性的。
分析未经DSS干预的HC和LC饮食动物的肠道菌群发现，HC饮食小鼠粪便菌群多样性降低(p=0.0022，图3B)，且其组成也发生明显改变（p=0.001，图4），包括门水平相对丰度的增加，厚壁菌的减少。这些变化持续48小时以上，在饮食不变时保持稳定。把HC或LC饮食小鼠的粪便移植到标准饮食GF小鼠中，小鼠的疾病严重程度没有显著差异，表明酪蛋白和菌群对于疾病是必需的。
HC或LC饮食且未经DSS处理的小鼠结肠组织转录谱提示，酪蛋白减少与细胞粘附相关基因（如AOCS3、LAMC1、KRT17和DES）的表达增加，与肌动蛋白细胞骨架和中间丝相关的基因增加都具有相关性。当HC饮食小鼠中细胞粘附相关基因表达降低时，HC饮食小鼠肠通透性呈现依赖肠道菌群的增加（图3C），而肠运动没有差异。
DSS模型中，抗生素疗效与其清除菌群的能力成正比。我们曾发现，酪蛋白是肠道菌群密度的潜在驱动力。我们从初始的筛选中分析了9种不同饮食对菌群密度的影响，其中含有不同量的酪蛋白(低、中、高)、玉米油(低、中、高)和蔗糖(低、中、高)。在未经DSS处理的小鼠中，酪蛋白的增加与肠道菌群密度的增加显著相关（R2=0.71，p=0.0045，图3D；），HC和LC饮食中菌群密度的平均差异为3倍。
图 3
在给予小鼠3%DSS后发现，饮食蛋白的增加也增加了肠道菌群密度(R2=0.88, p=0.0002)，且与DSS处理后7天的疾病严重程度以及结肠外植体的结肠TNF-α和IL-10显著相关（R2分别为0.59、0.73、0.45、P＝0.016、0.0035、0.049，图3E-F）。这提示，DSS诱导的炎症水平部分是由肠腔内的细菌密度驱动，这也解释了酪蛋白对疾病影响的菌群依赖性。随后，我们给小鼠LC饮食、HC饮食或HC饮食+含3mg/ml甲硝唑的饮用水，结果发现，甲硝唑处理导致了与LC饮食相似的肠道菌群密度。给予3% DSS时， HC+甲硝唑和LC饮食的小鼠之间的存活率没有显著差异。这两种降低菌群密度的干预措施使小鼠的存活时间显著长于HC饮食的小鼠（分别为p=0.0039，p=0.0033）。这些结果表明，HC饮食的DSS动物病理改变的菌群依赖性增加与菌群密度的增加有关，而后者与菌群多样性的降低和肠屏障功能的降低有关，可能通过增加抗原负荷而加重DSS诱导的肠损伤，从而增加微生物侵入相邻组织的可能性，或增加产生致病性代谢物的能力。
3 欧车前调节肠道通透性和结肠炎严重程度
我们在结肠炎诱导之前和诱导期间，持续数周检测高欧车前饮食（15%木质素；HPSY）或高纤维素饮食（15%纤维素；HCEL）的SPF和GF小鼠的存活率。结果发现，HPSY饮食的SPF小鼠平均存活27.6天，是HCEL饮食小鼠的4.6倍（6天，p<0.0001，图4A）。与酪蛋白的菌群依赖效应相反，GF动物也可以从HPSY饮食中获得保护作用，平均存活16.7天，比HCEL饮食的GF小鼠长3.6倍（4.7天，p<0.0001，图4A）。这些结果虽然提示在DSS诱导结肠炎的情况下，欧车前提供了一些与菌群无关的益处，但我们观察到HPSY饮食的SPF动物比GF动物明显更有益处（p<0.0001，图4A），这表明这些益处也还是菌群依赖的。
随后，我们检测了肠道菌群密度，并对未经DSS处理的小鼠在HPSY或HCEL饮食一周后所收集的粪便颗粒进行16S rDNA测序。相对于HECL饮食，HPSY饮食显著降低了小鼠肠道的菌群密度（P＝0.047），而且菌群也更加多样化（p=0.0012；图4B），并形成了不同的聚类（p=0.006）。具有相似基础菌群的不同批次小鼠，显示出对相同饮食干预相似、稳定的反应。随着欧车前饮食的增加，未经DSS处理的动物中的菌群多样性增加，而给予DSS后这些动物中的疾病也不那么严重。菌群移植实验证明，欧车前导致的菌群改变不足以引起结肠炎保护。
一些膳食纤维为细菌发酵产生SCFA提供底物，而SCFA增加CD4+FoxP3+调节性T细胞(Tregs)的数量和功能，后者在小鼠结肠炎模型中具有保护作用。因此我们用欧车前代替膳食纤维素，结果导致肠腔中丁酸浓度的增加（p<0.0001，图4C），结肠Treg细胞增加（p=0.0002，图4D）以及结肠炎T细胞转移模型中较轻的结肠炎。而且虽然口服SCFA可以直接增加GF小鼠的Tregs，但不足以保护GF小鼠(p=0.31），表明欧车前驱动的、依赖于菌群的SCFA、Tregs的增加不能解释欧车前菌群依赖性的保护作用。
图 4
我们在DSS治疗前后不同时间点给予小鼠HCEL饮食，然后用HPSY饮食代替，以此分析欧车前保护的动力学。在DSS治疗前2天或7天提供HPSY饮食可以产生相似的保护作用（分别为对照生存期的4.3/4.7倍；p=0.0034，p=0.0030，图4E），而在DSS给药开始时或开始后提供欧车前有显著但不如之前明显的作用。为了确定停用欧车前以后的保护期，我们在DSS治疗前后的不同时间点用HCEL饮食代替HPSY饮食，结果发现，实验期间给予欧车前的动物存活时间最长(存活增加4.7倍；p=0.0018，图4F)，当除去HPSY饮食时，保护作用迅速减少(存活增加2.3倍，第2天；p=0.0045)。这些结果表明，欧车前的有益作用迅速短暂，与适应性免疫系统的特征相悖，而符合更快的反应的特征，如先天免疫机制、屏障功能改变或转录变化。
为了明确欧车前对肠道屏障功能的影响，我们测定了HPSY或HCEL饮食的SPF和GF小鼠的肠通透性。在SPF和GF动物中，HCEL饮食的小鼠肠通透性都比HPSY高（p=0.0005，p=0.017，图4G）。然而，HCEL饮食的SPF小鼠与GF小鼠相比，膳食纤维对肠道通透性的影响具有菌群依赖性的差异(p=0.040，图4G)，而肠运动在HPSY和HEL饮食之间无差异。对结肠组织的转录谱分析发现，HPSY饮食驱动了与先天免疫应答（即中性粒细胞和巨噬细胞）相关的基因表达变化，并与宿主对细菌/LPS的应答（例如NCF2、PLSCR4和TIMP4）相关。
这些结果表明，欧车前在减少DSS病理改变方面的益处是迅速、短效的，不大可能由适应性免疫系统的变化引起。在未经DSS处理的小鼠中，欧车前不依赖微菌群和依赖微菌群的益处与肠屏障的改善、先天免疫和细菌应答相关基因的表达增加有关。而欧车前加强抗微生物免疫，限制微生物进入宿主组织，限制菌群密度，可能是欧车前相关的菌群多样性增加而带来的益处。
4 酪蛋白和欧车前对宿主生理和炎症的联合影响
人类饮食的一个关键特征是多种成分的连续变化和组合，这可以改变疾病的风险或病理。用低、中、高酪蛋白(6％、20％、41％)和欧车前(0、0.5％、5％)的所有九种可能的组合生成饮食方案，分析DSS给药后的小鼠体重改变，结果发现，组合后对体重变化仍具有显著影响，且欧车前的有益影响可以抵消酪蛋白的有害影响，而低欧车前、高酪蛋白和高欧车前、低酪蛋白的两个极端组合分别导致了最严重和最不严重的疾病。对每种成分以及组合情况分别进行线性回归发现，酪蛋白的单独线性回归可以解释33%的疾病变化（p=3.47x10-5），而欧车前为31%（p=7.41x10-5），联合作用为62%（p=4.64x10-10）。而且这两种成分对未经DSS处理的小鼠的肠道菌群密度(R2=0.46，p=2.80x10-6)和肠通透性(R2=0.63，p=2.41x10-4）具有联合作用，这也在很大程度上解释了DSS疾病严重程度的变化（71％；p=2.61x10-5）。正如我们之前发现的，膳食组合也能够改变不同菌群的丰度，其浓度与厚壁菌门和拟杆菌门(R2=0.85和0.72；p=0.003和0.023)的变化相关，与拟杆菌门呈正相关，与厚壁菌门呈负相关。
为了确定两者在人类肠道菌群的环境下对DSS结肠炎是否具有相同作用，我们在饮食变化（即低和高欧车前、酪蛋白的所有四种组合以及中欧车前和酪蛋白）的一个星期前，将人类粪便菌群注入到GF小鼠中。一周后，给予3% DSS处理，在第7天评价疾病严重程度，第4天测量粪便脂肪球蛋白-2。结果发现酪蛋白和欧车前的联合影响最好地解释疾病的严重程度（体重减轻和粪便脂蛋白-2R2＝0.72和0.69，P= 3.27×10-5和8.37×10-5）。与SPF小鼠菌群一样，人类菌群也随着饮食的变化而变化。总之，这些结果进一步表明结肠炎的严重程度是多种成分联合作用的结果，并表明饮食对结肠炎的影响在不同的菌群（即小鼠和人的菌群）之间是一致的。
评论
该研究首先筛选出了对DSS诱导小鼠结肠炎模型疾病严重程度（小鼠体重减轻为评价指标）影响最大的两种营养素——酪蛋白（加重疾病）和欧车前（减缓疾病），随后分别发现了这两种营养物质通过调节菌群密度、菌群构成、肠道通透性、菌群相关免疫活动等途径形成的作用机制，最后明确了两者对宿主生理和炎症状态的联合效应。这篇研究思路清晰，设计巧妙，论点明确，论据充分，研究结论丰富了人们对饮食、菌群、结肠炎相互关系的认知，对相关研究人员具有启发作用。小编能力有限，如有不足之处，还请指出，大家多多交流。感兴趣的朋友可通过查看原文了解更多。