TYRO3-平滑肌肉瘤的一个潜在的作用靶点
平滑肌肉瘤(LMS)是一种起源于软组织或内脏(包括子宫体，更罕见于骨骼)的平滑肌细胞恶性肿瘤。平滑肌肉瘤占成人肉瘤的15%，异质性强，是包含了不同级别和不同表现的一组肿瘤。大多数LMS是高级别肉瘤，并表现出临床侵袭性行为。局部治疗后5年的转移性复发率为∼40%，而晚期的治愈率仍然非常低(<5%)。细胞遗传学分析和CGH阵列揭示了多个染色体重排，并出现了分子亚类。然而，到目前为止，在这些疾病中还没有发现强烈的驱动基因改变。包括帕唑帕尼pazopanib和曲贝替定trabectedin在内的细胞毒性和靶向治疗可延长无进展生存期，而艾日布林eribulin可提高总生存期。然而，这些不同药物在LMS中的中位PFS接近4个月，几乎没有长期应答者，也没有关键的生物标志物被确定来指导治疗。TAM家族(Tyro3、Ax1和mer)是受体酪氨酸激酶(RTKs)的一个亚家族，TAM受体的过度表达已在多种肿瘤中被发现，具有调节不同的细胞功能，包括血小板聚集、免疫反应和细胞生长和分化。这些受体具有共同的配体，如生长抑制特异性基因6(Gas6)和蛋白S(Pros1)。在这些RTK中，Tyro3首先被发现在与脑内髓鞘形成相关的组织中表达。然而，越来越多的证据表明Tyro3在促进癌细胞的存活、耐药、肿瘤发生和转移方面具有致癌作用。
Tyro3受体的分子生物学。
Tyro3属于TAM RTK家族。在结构上，Tyro3在胞外部分、跨膜部分和胞浆内显示两个纤维连接蛋白III型结构域和两个免疫球蛋白(Ig)样结构域（如下图)。Tyro3受体通过Ig样结构域与配体结合。Gas6和Pros1是Tyro3的天然配体。配体结合后，Tyro3的酪氨酸残基被自动磷酸化，下游信号被激活。在某些情况下，即使在没有配体的情况下，也可以激活高水平的细胞质Tyro3。在这种情况下，它作为二聚体酪氨酸激酶发挥作用，并转化RatB1a成纤维细胞。这些数据表明，即使在没有配体的情况下，Tyro3也保留了全长Tyro3激酶的所有属性。
（Tyro3受体和配体蛋白质结构示意图。(A)Tyro3受体在其N端携带两个免疫球蛋白(Ig)样结构域，随后在C端胞内区携带两个纤维连接蛋白III型重复序列，一个跨膜区和一个酪氨酸激酶结构域。(B)生长抑制特异性6(Gas6)和蛋白S(Pros1)，Tyro3配体在其N端带有一个GLA结构域，随后在其C端带有四个EGF重复序列和两个层粘连蛋白G(LG)结构域。(C)Tyro3二聚体通过受体的两个N端Ig样结构域和两个C端的Lg区相互作用与配体结合，这两个区域共同构成配体的性激素结合球蛋白(SHBG)结构域。Gla结构域上的谷氨酸残基和钙离子(Ca2+)的γ羧基化，使Gas6和Pros1能够与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合，从而使Gas6和Pros1与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合。这两个LG结构域形成一个性激素结合球蛋白样结构域，并触发Tyro3的激活。)
最初提示Tyro3具有致癌能力的研究表明Tyro3转染的大鼠2成纤维细胞可以在软琼脂中生长。随后过度表达Tyro3的大鼠成纤维细胞能够在裸鼠体内形成肿瘤，Tyro3的转录本与人和小鼠乳腺肿瘤的相关性进一步支持了这一观点。像TAM受体家族的其他成员一样，Tyro3和配体的过度表达在大多数的癌症中被显示出来，并与较差的肿瘤预后相关。Tyro3和Axl蛋白在正常甲状腺细胞中检测不到，但在甲状腺癌细胞中显著上调和激活。Tyro3还触发ACTN4的酪氨酸磷酸化，ActN4是参与运动的肌动蛋白结合蛋白家族的成员。SiRNA敲除Tyro3可阻止黑色素瘤细胞迁移和侵袭。
Tyro3和Axl过表达与平滑肌肉瘤
在LMS细胞系中检测到Tyro3和Axl的高表达。Tyro3或Axl基因敲除使细胞增殖/集落形成减少。克唑替尼Crizotinib和福维替尼Foretinib(GSK1363089)减少Tyro3和Axl磷酸化、细胞凋亡、G2/停滞和减少集落形成。免疫组化检测107例肉瘤中，LMS中Tyro3和Gas6的表达高于其他肉瘤，仅LMS中有核Tyro3的表达。对251例肉瘤进行基因芯片检测，发现LMS中Tyro3和Gas6的表达明显高于其他肉瘤。高表达Gas6或PROS1的平滑肌肉瘤患者的PFS明显恶化。
Crizotinib和Foretinib是抑制间变性淋巴瘤激酶(ALK)、MET(原癌基因，受体酪氨酸激酶)以及Axl和mer的多靶点TKI，据报道，Foretinib的IC50较低。为了探讨克唑替尼和福维替尼是否也影响Tyro3的磷酸化，用抗磷酸化蛋白抗体对这两种药物作用下的LMS细胞提取物进行了免疫沉淀实验。结果显示，药物处理的细胞系中Tyro3磷酸化水平显著降低(如下图)。两种TKI均可降低不同细胞系Axl的磷酸化水平。这两种酪氨酸激酶抑制剂都像预期的那样针对Ax1，但也针对Tyro3。Crizotinib和Foretinib因此抑制细胞培养中Ax1和Tyro3的激活。
（克唑替尼和福维替尼使Tyro3和Axl磷酸化失活，导致细胞存活率下降。(A)用克唑替尼和福维替尼处理的LMS细胞裂解物中的PY20抗体免疫沉淀含有磷酸化酪氨酸的蛋白。IB118和SK-LMS-1也用同型对照抗体沉淀，如试板右侧所示。用抗Tyro3和-Axl抗体进行Western blot印迹分析。使用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)显示蛋白质印迹中Tyro3(B)或Axl(C)蛋白定量的图表。用指示浓度的克唑替尼(D)和福维替尼(E)处理平滑肌肉瘤细胞72 h，用细胞比色法(PROMEGA)测定活细胞数，并绘制与未处理对照的曲线。）
用特异性shRNA封闭Tyro3和Axl可同时抑制SK-LMS-1细胞的激酶表达和细胞增殖。然后使用两种不同的多靶点酪氨酸激酶抑制剂Crizotinib和Foretinib对Tyro3和Axl进行靶向治疗，Crizotinib是一种针对ALK和c-Met/肝细胞生长因子受体的多激酶抑制剂。Foretinib是一种双重c-met-VEGFR2受体抑制剂，目前处于II期临床试验。TKI都显著抑制Tyro3和Ax1。从实验结果上看，观察到了克唑替尼和福维替尼阻断了Tyro3和Axl酪氨酸激酶受体的磷酸化。克唑替尼和福维替尼均可减少或完全消除LMS细胞株中Tyro3和Ax1的磷酸化。在最敏感的LMS细胞中，Crizotinib或Foretinib可完全消除Tyro3的磷酸化。克唑替尼和福维替尼诱导的LMS细胞Tyro3磷酸化水平与药物敏感性呈显著正相关。
毫无疑问，Tyro3和Axl及其配体参与了LMS细胞系的生长，在肿瘤样本中存在并被激活，它们的表达与肉瘤患者的不良预后相关。靶向这些蛋白的特异性TKI可能代表了一种新的治疗LMS的潜在方法，值得进一步研究。