编译：秦时明月，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
木聚糖(XyG)是大多数植物初生细胞壁中含量较丰富的成分。虽然XyG的结构已经得到了深入的研究，但关于它的生物合成仍有很多未知的地方。本研究利用反向遗传学来研究拟南芥纤维素合成酶-C(CSLC)蛋白在XyG生物合成中的作用。研究人员发现，单独突变5个拟南芥CSLC基因中的任意一个都不改变正常的XyG水平。然而，多CSLC基因突变体显著降低了拟南芥XyG水平，并且在突变所有五个CSLC基因的突变体中没有检测到XyG。多CSLC基因突变体的生长具有轻微的组织特异性表型。尽管明显缺乏XyG，但CSLC五重突变体在全基因组水平上没有表现出明显的基因表达变化。5个CSLC基因均可与5个突变体互补，支持每个基因编码XyG葡聚糖合成酶的结论。系统发育分析表明，CSLC基因广泛存在于植物界，由一个古老的家族进化而来。这些结果证实了CSLC基因在XyG生物合成中的作用，本研究构建的突变体为研究XyG生物合成的分子机理以及XyG在植物细胞壁结构和功能中的作用提供了有价值的工具。
原名：The synthesis of xyloglucan, an abundant plant cell wall polysaccharide, requires CSLC function
译名：CSLC可促进植物细胞壁多糖木聚糖的合成
期刊：PNAS
IF：9.412
发表时间：2020.08
通讯作者：Federica Brandizzi & Kenneth Keegstra
通讯作者单位：密歇根州立大学
DOI号：10.1073/pnas.2007245117
经基因分型证实，本研究选用纯合cslc4-1、cslc4-3、cslc5-1、cslc6-1、cslc8、cslc12-2、cslc456-2三重突变体、两个四重突变体和五重突变体T-DNA插入系，之后对这些突变体及野生型进行了RNA-Seq分析，并对CSLC家族基因进行了RT-PCR和qRT-PCR分析。利用LC/Qt of MS测定了酶消化后AIR与HPAEC的组份以及各个突变体的异丙戊糖的糖苷键合作用，然后进行了cslc456812五元突变体的互补。最后研究人员通过系统发育树鉴定了不同植物群中CSLC的同源基因。1 CSLC蛋白具有序列相似性，但CSLC基因表现出不同的表达模式随着拟南芥和其他植物基因组序列信息的获得，与纤维素合成酶基因密切相关的基因家族被鉴定并命名为纤维素合成酶类(CSL)基因。推测表明，这些基因在植物细胞壁基质多糖的合成中发挥了作用，但很难提供实验证据来证明这一假说。Cocuron等人提供了拟南芥CSLC4基因编码葡聚糖合成酶的证据，该酶可能参与形成XyG的骨架。拟南芥共含有5个CSLC基因家族的成员：CSLC4、5、6、8和12。五种CSLC蛋白的氨基酸序列比对表明，它们有显著的序列相似性和相似的假定跨膜结构域的数量。此外，所有五种CSLC蛋白都含有在GT2多糖合成酶中发现的典型的D，D，D，QxxRW基序。这些相似性表明所有五种蛋白质都具有与XyG葡聚糖合成酶相同的生化功能。为了进一步研究CSLC家族成员的功能，研究人员检测了它们的表达模式。对公开的表达量数据的研究表明，CSLC4和CSLC8在拟南芥中广泛表达，尽管与CSLC4相比，CSLC8的表达水平较低。另外三个CSLC基因表现出更明显的表达模式，其中CSLC5在发育中的种子中高表达，而CSLC6和CSLC12在花粉粒中高表达。此外，CSLC4和CSLC12在根毛中都高度表达。因此，一些CSLC基因获得了组织或器官特异性表达，并可能在组织水平上具有非冗余功能。研究人员的下一个目标是通过分离五个CSLC基因中每一个纯合T-DNA插入系来验证CSLC基因可能在不同的器官或组织中分支成不同的功能群的假设(图1)。将单个cslc突变系杂交以产生各种双、三和四重突变体组合以及一个五重突变体(表1)。通过对每个等位基因的基因组DNA进行PCR(图1)以及对cslc456812五重突变体 (以下称为cslc五重突变体；图2)的RNA-seq分析证实了五个CSLC基因中每一个都存在T-DNA插入。通过这些方法，研究人员验证了cslc五重突变体中单个遗传位点的中断以及每个中断基因的全长转录本的缺失。研究人员接下来分析了各种单阶和高阶突变体的表型，重点分析了茎、根毛或花粉等普遍表达的组织或器官特定表型。在单阶cslc突变体的花粉大小或花序茎高方面没有发现显著差异。然而，与野生型相比，高阶cslc突变体表现出较小的花粉和较短的花序茎。带有cslc4等位基因的突变系表现出花序茎的弯曲(图3A)，表明这些突变体的茎较弱。此外，与野生型和其他突变体相比，具有cslc12等位基因的高阶突变体(即cslc45612和cslc456812)在1h授粉后表现出较短的根毛和较少的花粉管数量(图3B和C)。这些结果以及表达数据表明CSLC12可能与CSLC4结合，是根毛正常生长和花粉与雌蕊组织相互作用所必需的。综上所述，这些结果表明这五个CSLC蛋白在拟南芥发育过程中有一些重叠的和组织特有的作用。
图1 cslc单一突变体的分离。(A)所有5个cslc单一突变体的基因模型。(B)用基因特异性引物和T-DNA特异性引物进行PCR检测，确定每个cslc突变体的基因型。
图2 RNA-Seq证实cslc456812五重突变体中缺少全长转录本。
图3 CSLC的器官和组织特异性作用。(A)不同突变体的6周龄植株的表型。(B)不同突变体的1周龄幼苗的初级根的根毛。(C)野生型雌蕊以及用不同突变体的花粉给柱头授粉1小时后形成的花粉管。
如果CSLC蛋白参与了XyG的生物合成，那么CSLC基因的突变应该会导致细胞壁中XyG水平的下降。此外，由于早期对xxt1 xxt2突变体的研究表明该突变体缺少可检测到的XyG，因此考虑到cslc五重突变体和xxt1 xxt2突变体之间的表型相似性，研究人员假设cslc五重突变体将是XyG缺乏的(图3)。为了验证这一假设，研究人员采取了多种策略来确定cslc突变体细胞壁的XyG水平。第一种策略是检测异丙戊糖水平作为木聚糖水平的替代指标。用部分纯化的Driselase酶解cslc突变体下胚轴中的乙醇不溶性残留物(AIR)，以测定异丙戊糖含量。除了缺乏α-木糖苷酶活性外，该混合酶主要将细胞壁多糖降解为单糖，从而从木聚糖中释放异丙戊糖。研究人员采用高效阴离子交换色谱(HPAEC)结合脉冲安培检测(PAD)对消化后的细胞壁组分进行分析。结果表明，在所有测试的样品中都检测到了异丙戊糖，即使是xxt1 xxt2突变体和cslc的五重突变体也在异丙戊糖处显示出一个小峰(图4)。由于在之前对xxt1 xxt2突变体的研究中没有观察到低水平的异丙戊糖，因此研究人员收集了在异丙戊糖保留时间(∼10分钟)洗脱的突变体中的化合物，并用GC-MS进行连锁分析，以确定存在的糖苷键。当对xxt1xxt2突变体或cslc五重突变体(图4)的细胞壁降解物近10分钟洗脱的小峰进行连锁分析时，GC图谱在t-XYL或6-GLC糖苷键附近没有峰(图4)。此外，从xxt1 xxt2突变体和cslc五重突变体中记录的光谱在适当的保留时间内没有与t-XYL或6-GLC糖苷键一致的光谱(图4)。因此，虽然在异丙戊糖保留时间附近洗脱的物质成分尚不清楚，但研究人员得出结论，在xxt1 xxt2突变体中没有检测到异丙戊糖。研究人员还得出结论，cslc五重突变体缺少可检测到的XyG，因为CSLC基因可能负责合成XyG的主干。第二种策略是使用具有XyG(LM15)特异性抗体的简化多糖阵列来监测来自突变体下胚轴的细胞壁提取物中的XyG水平。以抗果胶多糖(LM6)抗体为对照。结果表明，cslc456-2三重突变体的XyG水平显著降低，而cslc五重突变体和xxt1 xxt2突变体均未检测到XyG水平。在所有被检测的植物中，果胶多糖的水平没有变化。第三种策略是评估XyG丰度，并使用MALDI-TOF质谱的寡糖质量图谱(Olimp)研究残留XyG的替代模式。在野生型细胞壁上观察到了代表已知XyG寡糖的离子信号。在三重突变体cslc456-1中，也观察到了所有这些离子，尽管与野生型相比数量较少。然而，cslc五重突变体细胞壁缺乏任何代表XyG寡糖的离子，证实了五重突变体中缺乏XyG或缺乏所用酶(XyG特异性内切葡聚糖酶)可获得的XyG。有趣的是，尽管cslc456-1三重突变体中的XyG水平降低，但下胚轴中的侧链替换模式保持不变。重要的结论是，这三种策略都提供了令人信服的证据，证明CSLC基因参与了XyG的生物合成。
图4 以异丙戊糖代表细胞壁降解物中的木聚糖含量。由拟南芥Col-0(图A)、clsc456812(图B)和xxt1 xxt2(图C)的黄化下胚轴制备的AIR中异丙戊糖含量的测定。
表2 Driselase消化不同拟南芥突变体下胚轴AIR后异丙戊糖的定量。4 所有CSLC蛋白家族成员都具有XyG葡聚糖合成酶活性上述试验为CSLC基因参与XyG的生物合成提供了有力的证据，其很可能参与了XyG葡聚糖骨架的合成。一个相关的问题是，这些基因编码的所有蛋白质是否与CSLC4在生化功能上是冗余的，CSLC4之前被证明具有葡聚糖合成酶活性。为了解决这个问题，研究人员利用每个CSLC基因回补了cslc五重突变体。CSLC4、CSLC5或CSLC6基因的互补由CSLC4启动子驱动，CSLC8或CSLC12的互补由35S组成性启动子驱动。研究人员对来自叶片的细胞壁材料进行Driselase消化，然后用LC/QT/MS测定异丙戊糖水平，分析了互补植株中的XyG水平。异丙戊糖水平以及XyG水平在每个互补系中都显著增加(表3)。此外，每个互补系的根毛都比cslc五重突变体长。虽然互补的程度是可变的，但在那些具有更多的XyG以及有更长的根毛的品系中，两种互补指标之间有很好的相关性 (表3)。这些结果使研究人员得出结论，每个CSLC蛋白都具有XyG葡聚糖合成酶活性。
表3 利用每个CSLC基因互补cslc456812五重突变体由于XyG是原生细胞壁中含量丰富的组分，因此XyG的缺失可能会激活回补机制。为了研究当XyG缺失时其他细胞壁成分升高的可能性，研究人员对野生型和cslc突变植株的细胞壁降解物进行了糖分分析，xxt1 xxt2突变体作为对照(图4，表2)。早期的研究表明，缺乏XyG的植物细胞壁没有回补作用。对中性糖组分的分析表明，高阶突变体降低了岩藻糖、木聚糖和非纤维素葡萄糖的水平，正如XyG降低所导致的那样。更重要的是，没有观察到其他糖的显著增加，这支持了cslc突变体没有过量生产其他细胞壁聚合物的结论。细胞壁聚合物丰度变化的一个更灵敏的指标是连锁分析。结果表明，xxt1 xxt2突变体和cslc456812五重突变体都降低了t-Xylp和4，6-Glcp的水平，这与XyG降低的水平是一致的。然而，与果胶或木聚糖等其他细胞壁组分没有显著变化。为了进一步研究可能的回补机制，研究人员假设，如果在cslc五重突变体中由于缺乏XyG而发生遗传重编程，那么该突变体将在参与细胞壁代谢的基因的表达和细胞壁相关基因的转录调控方面显示出显著的变化。为了测试这种可能性，研究人员通过比较转录组将野生型植物与cslc456-2三重突变体和cslc五重突变体进行比较，以寻找基因表达的变化。当使用DESeq2在cslc突变体中鉴定差异表达基因(DEG)时，在cslc五重突变体中发现了67个差异表达基因，在cslc三重突变体中发现了60个差异表达基因，与野生型进行配对比较后，这些基因的表达水平至少变化了两倍。在这些DEG中，41个在两个突变体中与野生型存在差异表达。在41个DEG中，只有2个基因的表达量高于野生型，而cslc三重和五重突变体中有39个基因的表达量低于野生型。然后，研究人员使用GO富集分析了特定生物过程中的基因集，重点是cslc三重和五重突变体中的DEG。没有发现显著的GO富集，表明由于细胞壁中XyG的减少，在特定的生物学过程中全转录反应没有被激活。另外，研究人员假设基因表达的变化将由核蛋白(如转录因子)来协调。15个DEG被预测编码定位于细胞核的蛋白，但所有DEG的表达水平都极低(RPKM<2)，这使得它们不太可能参与遗传重新编程过程。此外，研究人员注意到参与XyG、果胶和纤维素合成的其他基因的表达水平在RPKM值方面没有太大变化。大多数基因的log2变化均小于1，表明参与细胞壁合成或修饰的基因变化不大。只有XUT1、GAUT7、RGXT1在cslc五重突变体中有显著增加，但其表达量很低。综上所述，这些结果使研究人员得出结论，细胞壁中缺乏XyG并不会引发显著的转录反应。在确定所有CSLC都是XyG合酶之后，研究人员接下来分析了它们在植物基因组中的系统发育关系。因此，研究人员对从公开的植物基因组数据库中获得的CSLC蛋白序列(>90%的序列覆盖率)进行了跨物种系统发育分析。在使用最大似然法建立了系统发育树后，研究人员验证了CSLC蛋白的进化分支为五个主要组：一个古老的CSLC组，一个CSLC4组，一个CSLC6组，一个CSLC12组，以及CSLC5和8个组的簇(图5)。有趣的是，苔藓植物、早期胚胎植物如多形地钱草、泥炭草，以及古老的管状植物卷柏和蕨类植物(如满江红和葫芦巴)，只含有古老形式的CSLC类蛋白，这支持了这些生物的祖先系统发育地位。在植物群中的叶绿体序列中没有发现CSLC同源物，这与早些时候报道的叶绿体中缺乏XyG相关基因是一致的。在裸子植物和被子植物中都出现了CSLC6，在被子植物谱系中同时存在CSLC4和CSLC12，这支持了种子植物中CSLCs的多样性。研究人员还发现，单子叶植物和双子叶植物都含有CSLC4蛋白，但CSLC4基因的结构在两组植物中有所不同。在双子叶植物中，CSLC4基因是CSLC家族中唯一有四个外显子和三个内含子的成员(图1A)。相反，单子叶CSLC4基因与其他CSLC基因相似，因为它们有5个外显子和4个内含子。大多数双子叶植物在CSLC4、CSLC5、CSLC6和CSLC12亚科中至少有一个成员，而单子叶植物，特别是禾本科，至少有一个CSLC4或CSLC5基因的成员是CSLC12的重复拷贝。毛足类是被子植物的一个基本谱系，它含有CSLC5、6和12基因，暗示在禾本科植物进化过程中可能丢失了CSLC6基因并获得了额外的CSLC12基因。在拟南芥中，由于在花粉中的高表达CSLC6和CSLC12基因只存在于种子植物中(图5)，它们可能与被子植物生殖系统的进化有关。综上所述，这些生物信息学分析支持了CSLC基因的多样性增加，包括CSLC4基因在双子叶中的最新进化，很可能来自于祖先CSLC群体，以及XyG在植物繁殖中的重要作用。
本研究使用反向遗传学策略和分离的每个基因的单个突变体来研究5个拟南芥CSLC基因(CSLC4、CSLC5、CSLC6、CSLC8和CSLC12)的功能。然后，研究人员构建并鉴定了各种双、三、四个突变组合加上一个五重突变。研究人员确定CSLC蛋白在发育过程中有很大的重叠作用。此外，研究人员提供了确凿的证据表明，五个CSLC基因的突变使XyG的水平降低到能检测到的限度以下，而它并没有在转录水平上引发显著的适应性反应。研究人员还通过互补分析表明拟南芥CSLC蛋白负责XyG的生物合成。xxt1 xxt2突变体和cslc五重突变体的相似表型提出了关于XyG在植物细胞壁结构和功能中的作用的重要问题。植物细胞有一个以多糖为基础的壁，以保持它们的结构和功能的完整性，并决定它们的形状。细胞壁构件的重组是生长和分化所必需的。一种被认为在这种重组中起重要作用的基质多糖是木聚糖(XyG)。虽然XyG的结构已经很清楚，但它的生物合成机制还不是很清楚。本研究通过对拟南芥CSLC基因的遗传研究，证明它们负责XyG葡聚糖骨架的合成。5个cslc突变体能够正常生长发育，但缺乏可检测到的XyG。cslc突变体将是研究这些问题的有价值的工具。
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