科研 |MICROORGANISMS：转录组揭示草莓与角斑病菌互作的分子机制
编译：YQ，编辑：景行、江舜尧。
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植物生命周期中存在许多生物及非生物胁迫，并进化出复杂的防御响应机制。草莓是重要的经济作物，Fragaria × ananassa是其中一种八倍体杂交品种（2n=8x=56），由两种野生八倍体物种Fragaria chiloensis（智利草莓）和Fragaria virginiana（弗州草莓）杂交产生，基因组大小约708-720Mb。虽然目前缺少Fragaria × ananassa的全基因组序列，但研究表明F. ananassa的转录组数据可覆盖野草莓（Fragaria vesca）参考基因组的91.3%，野草莓基因组较小（~240Mb，2n=2x=14）。
草莓对许多病原菌敏感，其中草莓黄单胞菌（Xanthomonas fragariae）引起角斑病，对草莓砧木和产量造成严重损害。角斑病菌导致草莓叶背产生角状水渍斑，后期扩散形成坏死斑，最后植株维管组织受损。研究表明不同草莓品种对角斑病菌的敏感性不同，角斑病菌存在两种致病菌株，其毒力因子包括Ⅲ型分泌系统（T3SS）及其效应蛋白（T3E）、Ⅳ型分泌系统（T4SS）、Ⅵ型分泌系统（T6SS）。
论文ID
原名：Host–Pathogen Interactions between Xanthomonas fragariae and Its Host Fragaria × ananassa Investigated with a Dual RNA-Seq Analysis
译名：转录组揭示草莓与角斑病菌互作的分子机制
期刊：Microorganisms
IF：4.152
发表时间：2020年8月
通讯作者：Joël F. Pothier
通讯作者单位：瑞士苏黎世应用科技大学自然资源科学学院
DOI号：10.3390/microorganisms8081253
实验设计
结果
各样品RNA测序数据总量为3900万-1.49亿条reads（表1），过滤删除2.6-11.0%低质量reads。拼接到黄单胞菌参考基因组的reads数为123万-481万，占reads总数的2.58-8.51%；拼接到草莓参考基因组的reads数为3263万-1.0997亿，占reads总数的83.44-90.7%。主成分分析显示采集时期影响基因表达水平（图1）。
2 黄单胞菌的基因表达
在侵染末期，黄单胞菌有5个基因表达上调（图2a）。这些基因中存在一个钙结合蛋白基因（假定RTX毒素）（表2）。溶血性和溶细胞性RTX毒素是产毒细菌的重要致病因子，这表明黄单胞菌在侵染后期（症状发展末期）产生毒素。在139个侵染早期高表达的基因中，部分基因功能与毒力相关因子和宿主互作因子相关。其中包括T3SS的三个结构蛋白，HrcC和HrcJ是T3SS的膜结构装置蛋白，HrcU与开关蛋白（T3S4）HrpB相互作用，控制效应蛋白分泌。本研究中调控基因hrpB、hpa1、hpaB在12dpi时表达上调，hrpB是T3SS编码基因的激活因子，hpa1和hpaB影响菌株毒力。与培养基中生长的细菌相比，在植物中细菌这些调控基因的表达显著上调，这证明T3SS在病原侵染早期的重要作用。三个效应蛋白基因xopN、xopR、xopV在侵染早期表达较多，它们通过抑制宿主免疫反应促进毒力因子作用。一个T4SS菌毛基因pilQ在侵染早期表达较多，它与致病性和生物膜形成相关，但在培养基中表达较多，在植物宿主中表达较少。T6SS的三个基因也在12dpi高表达，针状蛋白Hcp形成细胞外分泌的管状结构，VgrG蛋白是效应蛋白定位运输的重要组成部分，膜蛋白EvpB包裹在Hcp周围，推动效应蛋白穿过细胞膜。T3SS、T4SS、T6SS的差异表达基因是对黄单胞菌进行突变分析的候选靶标基因，因为它们可能是重要毒力因子，可揭示其对细菌毒力作用的影响。其它早期高表达的基因包括伴侣蛋白GroEL（一种诱导宿主先天性免疫的抗原）、谷氨酸合成酶GlnA、富亮氨酸蛋白。GO富集分析显示生物合成过程、翻译、代谢过程相关基因在12dpi高表达（图3）。在感染早期，高表达的膜蛋白编码基因OmpA和OmpW可以通过锚定宿主细胞而促进致病，可能参与生物膜的形成。生物膜促进细菌在宿主或非生物表面的粘附，从而使细菌抵抗物理压力，提高在宿主内的适应性。根据转运蛋白分类数据库（TCDB），两个在感染早期表达较高的细菌TonB依赖受体（TBDR）均参与铁离子的结合和运输，研究表明细菌可以利用铁吸收系统促进其在宿主体内繁殖和感染，缺铁可以抑制草莓黄单胞菌的增殖及宿主症状发展。
12dpi的高表达基因明显比29dpi多，说明细菌在早期侵染阶段更活跃。12dpi时致病基因表达较高，且29dpi时细菌增殖下降。细菌生长受限和代谢变化的原因可能为植物的免疫反应和营养物质的缺乏。此外，毒力相关基因在感染后期表达较低，说明黄单胞菌是一种活体营养型病原体，其基因组中存在的细胞壁降解酶（CWDE）也证明这一观点。然而，研究表明T3SS可导致宿主细胞死亡，表明它可能是一种半活体营养型细菌。
图3. 黄单胞菌29dpi下调基因的GO富集。在生物学过程和分子功能水平分类，以百分比表示。
3 草莓的基因表达
RNA-seq数据显示141个基因在29dpi时高表达，220个基因在12dpi高表达（图2b）。相同通路的基因有些在早期表达，而有些在感染后期表达（表3）。富集的通路中主要是生物和非生物胁迫响应相关基因，包括谷胱甘肽代谢和细胞色素P450。谷胱甘肽影响细胞内活性氧（ROS）水平，参与植物过敏性反应（HR），细胞色素P450则参与植物发育和抗氧化反应。因此本研究选择的草莓品种不是高度感病的。富亮氨酸蛋白（LRR）是抗病相关通路的一部分，可识别病原并激活防御反应，通常通过感知病原相关分子模式（PAMP）启动免疫反应。参与生长素（IAA）和乙烯（ET）通路的编码基因是生物胁迫响应的关键，可通过激素浓度调控植物衰老过程。这些基因的差异表达表明植物防御途径与在症状发展过程中有一个长期的变化过程。
感染晚期表达下调的基因中，有54个基因与叶绿体相关：9个与光系统Ⅰ/Ⅱ相关，14个与叶绿素a/b结合相关，4个与质体-脂质相关，6个与葡萄糖异生或柠檬酸循环相关。叶绿体在植物免疫中发挥重要作用，介导关键的防御相关物质的生物合成，如激素和第二信使。光合作用基因的下调是由于植物体内的能量被用于防御反应。研究表明T3SS效应蛋白可以攻击宿主叶绿体，破坏光系统Ⅱ，从而抑制光合作用和PAMP诱导的活性氧产生。然而，抑制光合作用可以使植物抑制病原体增殖，或保护光合系统免受氧化损伤。
感染晚期表达上调的基因中，有4个基因参与植物防御反应调控，如WRKY转录因子。NAC结构域蛋白在感染后期也高表达，控制植物发育、防御反应和非生物胁迫响应等。有16个抗病相关基因也在感染后期表达，其中葡聚糖酶基因2个、几丁质酶基因3个、类奇甜蛋白基因3个、葡糖苷酶基因4个。
总体而言，GO富集显示12dpi是高表达的基因与光系统Ⅰ/Ⅱ、代谢过程、跨膜运输过程、防御反应相关（图4）。这表明12dpi时草莓植株的防御反应已被激活，而在29dpi时反应下降。因此，草莓在被黄单胞菌早期侵染时主要改变了叶绿体代谢，剥夺细菌获取营养的途径，并且诱导细胞死亡。
图4. 草莓接种黄单胞菌12dpi和29dpi的差异表达基因GO富集。在生物学过程、细胞成分、分子功能水平分类，以百分比表示。
讨论
草莓是重要的经济作物，但对多种病原菌敏感。其中黄单胞菌是严重危害草莓的一种检疫性细菌病原体，可引起草莓角斑病。本研究利用转录组技术在两个时间点分析植物和细菌的基因表达，从而对比侵染早期和侵染晚期的病原和宿主反应。在已知的草莓28588个基因和黄单胞菌4046个基因中，有361个植物基因和144个细菌基因在两个时间点均表达，植物中早期表达较多的基因是叶绿体代谢和光合作用相关编码基因。本研究首次研究了草莓和黄单胞菌的相互作用，揭示了宿主与病原的适应性策略。
结论
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END