科研 | MOLECULAR ECOLOGY: 萤火虫的比较转录组学分析，以探索对淡水的分子适应性（国人佳作）
编译：澜粒粒，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Comparative transcriptomic analysis of fireflies (Coleoptera: Lampyridae) to explore the molecular adaptations to fresh water
译名：萤火虫的比较转录组学分析，以探索对淡水的分子适应性
期刊：MOLECULAR ECOLOGY
IF：5.855
发表时间：2020.06
通讯作者：张棋麟&陈均远&袁明龙
通讯作者单位：昆明理工大学&中国科学院南京地质古生物研究所&兰州大学
DOI号：10.1111/MEC.15504
实验设计
从江西省赣州市萤火虫培养中心获得了A. leii的雌雄成虫和L. praetexta的2龄幼虫。A. leii按照前人的方法培养，L. praetexta是在中国广西北海南京大学Evo-dev研究所饲养的。样本被独立收集三次，产生三个生物复制品，以消除下游基因表达分析中的偶然生物变异性。为了避免因幼虫龄期不同而引起的基因表达变异，并充分覆盖每个幼虫期的基因，将5个幼虫期（2～6龄）的总RNA进行汇集（等量）。雌雄成虫的RNA样本同样被汇集起来，以覆盖来自不同性别成虫的更多基因，并消除性别间的基因表达差异。最后，分别产生幼虫和成虫的混合RNA，进行转录组学分析，结果用qRT-PCR方法验证。图1给出了实验和生物信息分析的流程图。
图1 实验和生物信息分析流程图。水生萤火虫幼虫生活在淡水环境中，而它们的成虫是陆生的；陆生萤火虫的幼虫和成虫都是陆生的。差异表达基因。GO：gene ontology。KEGG：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes。另一种水生萤火虫：Luciola aquatilis；两种陆生甲虫：Tribolium castaneum和Dendroctonus ponderosae。
结果
1 水生谱系的进化制约
最初通过两种方法（HaMSTR和BRH）分别识别了3711个和3867个单拷贝正交图，提取了2914个共享正交图（交叉点）（图2A）。最后保留了2758个比对滤波正交图，用于进一步的进化分析，并基于连接的正交图重建了系统发育树（图2B）。在所有2758个直系生物中，A. leii和L. praetexta的每个分支的平均Ka/Ks比率都显著低于系统发育树的其他三个末端分支（L. praetexta vs. T. castaneum的Ka/Ks比率在陆生昆虫中最低，p=8.16 e-33；A. leii vs. T. castaneum的p=6.14 e-18）（图2C）。这表明在水生谱系中存在全基因组的进化限制。此外，还计算了2758个正交图拼接路线的每个分支和从10个随机选择的正交图构造的1000个拼接路线的Ka/Ks。与其余分支相比，这些分支的所有水生谱系的Ka/Ks值也明显较低（L. praetexta vs. T. castaneum的Ka/Ks值在陆生昆虫中最低，p=4.73E-33；A. leii vs. T. castaneum的p=5.12E-18）（图2D和E）。
图2 基于系统发育树计算的Ka/Ks比值，用于从每个直系生物中获得的末端分支。（A）仓鼠和BRH鉴定的单拷贝同源基因数的Veen图。（B）本研究所使用的系统发生树。（C）从每个正交对数中获得的终端分支的Ka/Ks值。（D）从所有正交日志构造的连接路线。（E）由10个随机选择的正交曲线构造的1000条串联路线。AL，A.leii；LA，L.aquatilis；TC，T.castaneum；LP，L.praetexta；DP，D.ponderosae。
2 水生萤火虫的快速进化和正选择基因
分别有102个和79个快速进化基因在A.leii（图2B所示的b分支）和L.aquatilis分支（c分支）中，114个和211个快速进化基因在A.leii和L.aquatilis的祖先分支（A分支）及其整个分支（表S5）中。表S6显示了a、b和c分支以及A.leii和L.aquatilis整个分支中的阳性选择基因。在至少一个水生分支（a、b、c和整个分支）中，共检测到341个快速进化基因和116个阳性选择基因。
为了确定有助于淡水适应的基因，我们重点研究了A.leii和L.aquatilis四个分支的76个快速进化和阳性选择的基因（表S7）。其中18个候选基因与氧利用和能量代谢相关：NDUFA9、ATP5H、TRMU、HSP60、ATPA、MAP3K、NAD7、ATP5B、AHSA、MAPK、MCFW、AARS2、ATP6V1E、TIM14、MIRO、TRMT10C、PROPOA3和HSC70-5（表1）。表现出快速进化和阳性选择的基因显著地丰富到五个GO类别，包括“细胞内蛋白质转运”（GO:0006886）、“细胞质”（GO:0005737）、“线粒体”（GO:0005739）、“ATP结合”（GO:0005524）和“氧化磷酸化”（GO:0006119）。
图3 进行基因表达分析的总结与统计。（A）（B）A. leii和L. praetexta样品间相关系数值的热图。A. leii和L. praetexta幼虫和成虫之间由差异表达基因（DEGs）富集的GO（C）和KEGG（D）的维恩图。相关系数接近1，表明两个样本最相似。最小值和最大值分别用红色和绿色表示；颜色渐变表示中间值。
3 差异表达基因的鉴定及功能分析
A.leii成虫和幼虫共有7271个差异表达基因，其中4144个基因表达上调，3127个基因表达下调（表S8）。L. praetexta的成虫与幼虫相比，共有8309个差异表达基因，其中有3984个上调基因和4325个下调基因（表S9）。
GO富集的结果表明，生物过程中的A. leii显著富集到64个GO term（表S10），而L. praetexta中鉴定出54个GO term（表S11）。这不包括那些参与淡水环境中的非适应性功能，例如萤火虫的发育、生长和繁殖。41个A. leii谱系特定的GO分类（具有适应淡水的功能）在A. leii中富集（图3C）。在这些GO分类中，有几个 term与缺氧适应（“线粒体组织”、“过氧化物酶体组织”和“氧化还原过程”）、免疫应答（“细胞表面受体信号途径”、“凋亡过程负调控”、“免疫应答”、“防御应答”相关，以及“吞噬”），和ATP产生（“ATP水解耦合质子传输”和“ATP合成耦合质子传输”）。有趣的是，在A. leii谱系特有的GO术语中，发现了几个与低氧和水压适应有关的昆虫形态GO分类——“管的大小调节，开放的气管系统”，“呼吸器官形态发生，开放的气管系统”和“表皮几丁质生物合成过程”可能与耐水压、复眼形态发生和复眼发育可能与低光照强度的接受性有关。相比之下，L. praetexta 的差异基因很少有这些GO分类被富集到的L. praetexta谱系特定GO分类中。
KEGG富集分析显示，A. leii和L. praetexta分别富集23和29 个KEGG路径（表S12和表S13）。与L. praetexta富集的KEGG路径相比，A. leii中发现了9条谱系特异的KEGG途径（图3D和表2）。参与缺氧和ATP产生的途径过多，包括“氧化磷酸化”、“柠檬酸循环（TCA循环）”、“mTOR信号途径”和免疫相关途径“溶酶体”。相反，很少检测到KEGG通路参与了L. praetexta谱系特异性信号级联的这些功能。与水生幼虫相比，生活在陆地环境中的大多数A. leii成虫在氧化磷酸化途径中的基因表达上调（图S2）（表达水平在水生幼虫中被抑制）。这在线粒体电子传递链（ETC，复合物I-IV）中尤为明显。然而，更多编码ATP酶的基因在A. leii成虫中表达下调。对于TCA循环途径（图S3），更多基因显示上调表达，表明在水生A. leii幼虫中表达受到抑制。在mTOR信号传导途径中，更多的基因在生活在陆地环境中的A. leii成虫中表达下调（图S4）。在溶酶体途径中（图S5），当A. leii幼虫生活在水生环境中并发育为陆生成虫时，大多数基因的表达下调。
4 A. leii适应淡水环境的差异表达基因
对21674个A. leii和L. praetexta之间的同源序列进行下游分析。为了通过表达变化确定可能有助于A. leii淡水适应的基因，提取了1445个A. leii谱系特异性DEGs（表S14）。其中，涉及缺氧、ATP生成、几丁质代谢和复眼形态发生的基因集（包含74个已鉴定的候选基因）被鉴定出来（表3）。15个DEGs被鉴定为具有快速进化和阳性选择的基因（表1）。
与淡水幼虫相比，在48个涉及缺氧反应的注释A. leii成虫中，大多数显著上调（32个上调而16个下调）（表3）。这表明这些基因的表达在淡水幼虫期受到抑制。32个上调的A. leii的差异基因编码细胞色素c氧化酶和其他氧化酶相关蛋白（如CO6A1、CO7A1和COA7），NADH的脱氢酶（如ND3、NDUFS4和NDUB2）、脱氢酶和脱乙酰酶（如SDHB、MDH2和HDA4）属于TCA循环途径。这些在淡水鱼低氧适应的氧化磷酸化过程中起着重要作用。此外，陆生A. leii成虫体内的几种下调的差异基因与过氧化物酶功能有关，过氧化物酶能消除缺氧诱导的活性氧。A. leii谱系特异性表达变化涉及ATP的产生（如ARL6、ATP5E和ABCG8）强调了充足ATP供应的重要性，这是适应淡水的代谢需求。6个A. leii谱系特异性差异基因与几丁质代谢相关（如CDA家族、CHS2和CHT3），5个差异基因与复合眼形态发生相关（如HTRA2、ARF1、STAR、HST1和SRA）。
讨论
与淡水适应相关的全基因组进化限制
生态胁迫限制了动物全基因组的进化模式（例如，较少的杂合位点和较低的进化率）。在这项研究中，水生萤火虫的平均进化速度（在基因组水平上）比陆地萤火虫慢。这表明，它们的水生生活方式限制了全基因组的进化。
代谢效率的改变有助于淡水适应性
研究者在与水生适应相关的基因中验证了代谢效率的改变有助于淡水适应的这一假设，包括那些经历了积极选择、快速进化和对淡水反应的表达变化的基因。这些基因在涉及能量代谢、线粒体功能、细胞内蛋白质转运、细胞质、缺氧反应和线粒体ATP生成的GO term中显著丰富，有助于昆虫的生态适应。
18个基因与缺氧和ATP代谢密切相关，具有序列变异。这说明水生昆虫的低氧适应需要氧气的调节摄取和消耗，从而影响了代谢率。ATP5H、ATPA和ATP5B基因（线粒体ATP合酶的重要F0和F1亚基）也参与了提供能量的营养物质（如糖、油和蛋白质）的代谢和通过调节线粒体的功能和状态而产生的缺氧反应，它是后生动物有氧呼吸和细胞能量代谢的中心。线粒体呼吸链复合物I（NADH：泛醌氧化还原酶）的NAD7通过氧化还原驱动的构象能量转移间接泵送质子。线粒体分布的变化会影响小鼠胚胎成纤维细胞的细胞质能量供应（包括ATP/ADP的减少），并破坏细胞对MIRO缺乏的正常运动。因此，MIRO可能与线粒体功能有关，并且可能对能量代谢效率的改变很重要。新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后，线粒体HSP60在胞浆中的免疫反应性立即增加了2倍。HSC70-5是视神经萎缩1（OPA1）样蛋白的关键相互作用者，通过线粒体融合影响果蝇细胞内稳态。这些研究为线粒体功能作为萤火虫淡水适应的一部分提供了分子证据。水生萤火虫特异性DEGs也参与代谢效率和缺氧，例如编码细胞色素（c氧化酶、b和P450）、NADH脱氢酶、过氧化物酶体瘤和HSPs的基因。这些蛋白质通常与人类、大鼠和蝙蝠的细胞耗氧量、ATP生成和能量代谢有关（Reynolds等人。有趣的是，15个经历快速进化和正选择的基因在水生萤火虫中也表现出不同的表达水平，并且主要与代谢效率有关。
这些结果表明，代谢调控基因通过表达水平和序列的改变促进淡水适应。在DEGs的富集分析中，检测到了几种参与代谢效率的KEGG路径，在淡水萤火虫中有表达水平的反应。例如，有几项研究报告了缺氧条件下氧化磷酸化途径（复合物I-V）中的基因表达受到抑制。在这项研究中，抑制氧化磷酸化途径中的基因表达可能是改变水生萤火虫氧气使用的关键机制。TCA循环途径是一个水生萤火虫谱系特有的KEGG路径在本研究中被确认。mTOR信号通路与对缺氧的适应有关。此外，TOR活性降低导致了缺氧期间RNA对蛋白质翻译的下调。在缺氧条件下，免疫相关途径往往与平衡选择有关。结果表明，溶酶体途径在水生萤火虫体内特别丰富，提示免疫相关途径可能通过平衡氧的使用来调节水生萤火虫的低氧适应。总之，这些重要的耗氧相关基因提供了证据，表明代谢效率的改变可能有助于淡水适应。
形态学淡水适应性
快速进化和阳性选择的基因与形态无关。然而，一些候选基因（调节几丁质代谢和复眼形态发生和发育）的表达变化可能有助于增加对水压、热损失、水生刺激物和水面以下有限光的抵抗力。
先前的研究报道了CHS2在调节双形真菌渗透压中的关键作用，以及重组CHT3和IDGF蛋白的免疫保护功能。含有几丁质的昆虫外骨骼的细胞外基质可以被修饰，以提供非常坚硬和厚或薄和灵活的角质层。此外，气管管道的特殊结构和含有几丁质的衬里代表了独特的生理特征。几丁质脱乙酰酶（CDA）与几丁质相互作用并对其进行修饰，对昆虫发育过程至关重要。一些CDA编码基因被鉴定为水生萤火虫谱系特异性DEGs，提示CDA的表达变化可能与水生萤火虫对呼吸、运动和水压的适应有关。此外，一些水生萤火虫特有的GO分类涉及开放气管系统的大小和形态以及表皮几丁质的生物合成。昆虫复眼在解剖学、光学和生理学方面与其他动物有着显著的不同。以往的研究报道了北京萤火虫（phroocelia pekininsis）复眼在不同光照强度下的不同成像特征。鉴定了几种差异基因（如HTRA2、ARF1、STAR、HST1和SRA），它们在复合眼形态发生和发育（水生萤火虫谱系特定GO分类）中功能丰富。这些DEGs可能通过调节基因表达水平参与水下萤火虫对水下光环境的适应。
评论
本研究利用Lampyridae科昆虫的遗传资料，探讨昆虫对淡水适应的分子基础。记录了与代谢效率（如缺氧反应、ATP生成和线粒体功能）和淡水生活方式（如气管、角质层和复眼）相关的形态特征基因的适应性变化。观察到序列和表达水平的变化，可能有助于萤火虫淡水适应。值得注意的是，一些靶向基因没有功能注释和/或与淡水生活方式相关的代谢效率和/或形态特征不相关。尽管如此，这些基因确实经历了对淡水的适应性进化。
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