miRNA、lncRNA 敲除细胞系构建技术原理

基因敲除敲入技术一直是研究特定基因功能的有效工具。近10年来，mRNA在医学应用领域取得显著进展。研究人员可快速合成任意序列的mRNA片段，并能保存在室温条件下。在无细胞的体系中利用DNA转录生成cap和poly A修饰的mRNA分子稳定性良好，而修饰碱基的mRNA在稳定性上更获得大幅提升。在研究基因敲除动物及其胚胎发育中的基因表达时，科研人员往往都采用卵母细胞的mRNA显微注射的方法，该方法在ZFN、TALEN、CRISPR、重编程细胞多能性等技术中得到广泛应用。在这些基因编辑过程中使用mRNA较之DNA有诸多优点，例如无需进入核内并转录效率更快，RNA易降解也避免基因组遗传重组现象。

我们利用该技术，定点敲除和修饰各种细胞系中的特定基因。对打靶细胞进行药物筛选，利用CRISPR/Cas系统获得的基因敲除细胞的剔除效率会明显高于常规的利用RNAi和shRNA介导的基因敲落。

技术特点

1.可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除

2.最新Nickase酶/双gRNA技术，显著降低脱靶率

3.无种属限制，适用于各种细胞系的靶向敲除

操作流程

靶向目标序列sgRNA的设计及载体构建

目标细胞系共转染

阳性细胞株的筛选和鉴定

应用范畴

基因功能分析：在细胞水平研究基因的功能

定点突变：建立点突变细胞，可用于药物靶点研究。

启动子功能分析：该方法建立的启动子分析系统，可有效地分析内源性启动子的强度，是一种最理想的分析系统。