科研| HEPATOLOGY：多组学揭示脂质重塑在肝细胞增殖和肝细胞癌中的作用
编译：思越，编辑：谢衣、江舜尧。
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肝细胞在代偿性再生和肝细胞癌（HCC）时，会进行代谢重建。但是其中的代谢过程尚不完全清楚。为了捕获增殖肝细胞的代谢特征，作者使用系统生物学方法建立肝再生、药理、遗传激活的细胞增殖以及HCC的模型，整合代谢组学，脂质组学和转录组学，将增殖性肝细胞脂质组中的变化与改变的代谢途径联系起来，观察脂质代谢途径的改变。
论文ID
原名：Lipid Remodelling in Hepatocyte Proliferation and Hepatocellular Carcinoma
译名：脂质重塑在肝细胞增殖和肝细胞癌中的作用
期刊：Hepatology
IF：14.679
发表时间：2020.05.27
通讯作者：Michele Vacca & Julian L. Griffin
通讯作者单位：剑桥大学
实验设计
在本文中，作者整合了代谢组学、转录组学等多种组学技术，运用系统生物学的方法，表征肝细胞增殖（0.1％苯巴比妥（PB）诱导）、HCC小鼠模型（N-二乙基亚硝胺（DEN）诱导）、HCC癌基因模型等不同肝损害模型中的代谢重排。
实验结果
1 增殖和癌症期间的代谢重塑
作者使用肝切除术（PH）、四氯化碳（CCl4）诱导的急性毒性损伤以及苯巴比妥（PB）诱导直接引起肝脏增生的小鼠模型，去阐明正常肝细胞在增殖时发生的代谢反应。72小时后，所有组别的肝细胞均表达了增殖细胞核抗原（PCNA），说明已激活增殖过程。并给予小鼠正常饮食或高脂饮食（HFD）并维持在二乙基亚硝胺（DEN）暴露下，去观察肝癌增殖的差异。
使用下一代测序（NGS）和INGENUITY通路分析（IPA），作者研究了代偿性增生（PH和CCl4）和HCC（DEN / HFD）中调节的生物过程，发现通路/生物功能的上调和与细胞周期，存活，迁移，侵袭以及染色质和细胞外基质重塑相关，并发现炎症，血管生成和其他与多种癌症类型的生长相关的过程的上调。IPA预测到代谢涉及的多种经典途径和生物功能异常（图1A），包括氨基酸分解代谢以及核受体过氧化物酶体增殖物活化受体的抑制，以及碳水化合物代谢，以及脂质和胆固醇积累过程的激活。仅在PH和DEN / HFD中预测脂质合成增加，而在肝毒性和癌症模型（CCl4和DEN / HFD）中预测出氧化应激增加，且抑制脂肪酸氧化（及相关途径）主要发生在CCl4模型中。
接着，作者使用IPA研究了上游调控因子的激活状态（图1B，C），预测出大量核受体及共激活因子（Nrip1，Pxr，Rara，Ar，Vdr）以及葡萄糖和脂质代谢其他关键调节因子的激活。其中抑制性上游调控因子与葡萄糖和脂质代谢正相关，与细胞增殖与癌症（Pten，Hnf1a / b，Foxa1，Acox1和Apoe）负相关。这些结果表明，肝细胞代谢的激活在转录水平上表现，并且脂质和氨基酸代谢相关因子正逐渐向增殖过渡。
图1 增殖和癌症中脂质和氨基酸代谢差异
2 增殖性肝细胞具有独特脂质成分
为了研究脂质代谢的变化，作者对代偿性增生（PH和CCl4）和直接增生（PB）模型进行了脂质组学实验。对于所有三种模型，增生的肝组织展现出不同的脂质谱（图2A）。使用正交投影对潜在结构进行判别分析（OPLS-DA; R2 = 0.89，Q2 = 0.82，p <0.001），发现代偿性增生组中含有单不饱和脂肪酸（MUFA）的磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰乙醇胺（PE）40：6，短链甘油三酯（TAG）和游离胆固醇增加，含多不饱和脂肪酸（PUFA）的PC和鞘磷脂（SM）40：1减少（图2B）。另一方面，PB处理后的直接增生显示TAG、胆固醇酯（CE）普遍增加，增加，PC（38：6）和PC（32：0）减少（图2C）。TAGs和胆固醇在增殖过程中的增加与转录组分析趋势一致，该转录途径的特征是脂质的积累和抑制脂肪酸氧化。但是，含单不饱和脂肪酸的卵磷脂（PC）显着增加，在所有模型中都是一致的（图2D）。
图2 肝细胞增殖的小鼠的脂质谱变化
3 单不饱和卵磷脂（PC）在肝癌肿瘤中蓄积
接下来，作者研究了DEN小鼠模型中HCC与相邻的非肿瘤组织（正常饲料喂食或HFD饮食）的脂质组变化。通过LC-MS检测并经过主成分分析，四个组在脂质方面似乎有很好的区别，在第一主要成分中按饮食划分样本（图3A）。肿瘤样品相比于非肿瘤样品，肿瘤的TAG，CE和MUFA-PC升高，而PUFA-PC降低（图3B）；在配对分析中，两个DEN饮食组的肿瘤中MUFA-PC的水平均显着增加（图3C）。接着作者使用质谱于组织切片，证实了在正常饲料模型和HFD模型的肿瘤中MUFA-PC的增加和SM（40：1）的降低（图3D），并突出了非肿瘤相邻组织的脂质的区域分布（图3E）。
作者采用肝细胞增殖和自发肿瘤发生的可遗传处理的小鼠模型，Ras和Myc（人类肝癌中突变或扩增的已知致癌基因）的伴随活化导致肝细胞快速增殖，并广泛形成小而高度增殖的肿瘤。与DEN诱导的肿瘤相似，发现肿瘤病变中MUFA-PC（特别是PC（34：1））增加（图3F），并有明显的增生。
在小鼠中观察到脂质分布变化后，作者试图确认这些变化是否与人类HCC相关，使用由脂肪肝发展而来的HCC样本，比较肿瘤与肺肿瘤之间的脂质谱，也发现MUFA-PC增加，缩醛磷脂的减少（图4A），并使用质谱验证了MUFA-PC的大量增加。这些数据进一步证实，含有MUFA-PC的增加，是与肝细胞增殖及肝细胞癌变相关的关键事件。
图3 HCC不同模型中的MUFA-PC均增加
4 肝脏再生和癌症中的代谢重编程
作者测量了一组核心水性代谢物的变化。PH和CCl4处理组中，肝脏再生过程中代谢物谱与相应的对照组有明显区别，而PB处理与对照组相比没有变化。并且发现PH或CCl4损伤后的整体肝脏再生，导致多种氨基酸（谷氨酸，脯氨酸，亮氨酸）显着增加，参与磷脂生物合成的代谢产物（CDP胆碱），以及核苷酸中间体（5-磷酸核糖，胞苷）的增加。接着作者测量了人类肝癌和非肿瘤组织的水性代谢产物谱。发现赖氨酸，组氨酸和丙氨酸在肝癌中显着增加，而天冬氨酸明显减少，且与非肿瘤组织相比，HCC中CDP胆碱显着增加（图4C）。
总体而言，代谢组学结果与正在进行代谢重新连接的增殖细胞保持一致，以维持对氨基酸，磷脂和核苷酸的大分子生物合成的更高需求，并增加能量产生。
增殖细胞对糖原氨基酸（例如谷氨酰胺/谷氨酸）的需求增加，以便为生物合成提供氮和碳并通过TCA循环产生ATP。如同转录分析所强调，观察到的氨基酸增加可能受到其分解代谢抑制的驱动。
图4 人类肝细胞癌的脂质和代谢产物变化
5 代谢流增加磷脂的合成
代谢组学和脂质组学实验证明，在肝再生和癌症期间，MUFA-PC和CDP胆碱的含量增加。通过分析PH，CCl4和DEN / HFD样品的基因表达数据，使用差异基因表达模式对MUFA-PC的产生和体内稳态所涉及的主要代谢途径进行靶向分析（图5）。通过对肝细胞的基因组规模代谢模型（GEM）进行流平衡分析（FBA），从分解代谢途径开始，并与以抑制PPARα活性为特征的途径分析相一致（图1B），三组基因表达降低都呈现降低趋势，线粒体（Acads，Acadsb，Cpt2）和过氧化物酶体b-氧化（Acox1，Acox3）途径的代谢流下降（图5A）。
通过长链酰基辅酶A合成酶（ACSL）将FFA活化为脂肪酰基辅酶A。Acsl1的表达在各组中均持续降低，但Acsl4和Acsl5的表达均持续升高。在快速增殖期间，虽然整体上α-氧化被降低，但是PUFA和SFA优先于MUFA被氧化。在合成代谢途径中（图5B），作者发现脂肪生成基因（例如Acaca，Acly）的表达和/或代谢流，棕榈酸FFA的延伸率（Elov16）和去饱和度（Scd1 / 2）（16：0）到FFA（18：1）都增加，尤其是在PH和DEN / HFD模型中。
PC通过CDP-胆碱途径形成（图5C）。通过增加Chka的基因表达和底物（例如胆碱），该途径在增殖和癌症中被上调。SM的分解也可能有助于磷酸胆碱，作为进入CDP-胆碱途径的底物（图5C）。
图5 多组学揭示肝脏增殖和癌症中脂质代谢的广泛调节
6 单不饱和脂肪酸（MUFA）与肝细胞癌的遗传标记相关
在确定了增殖和癌症影响的脂质代谢途径后，作者评估了肿瘤组中的基因/代谢物相关性，以探究其浓度是否与增殖的关系。在DEN / HFD肿瘤组中，发现总MUFA-PC与Chka，Acly，Scd2，Lpl，Acsl4基因表达与胆碱，CDP-胆碱代谢物之间存在正相关关系。这表明肿瘤中MUFA-PC的增加与新生脂肪形成，Scd脱饱和和通过CDP-胆碱途径合成PC密切相关。另一方面，MUFA-PC与Acsl1，Pemt，Dgat2和Acad基因表达之间观察到强烈的负相关。MUFA-PC与增殖标志物（Ki67，Ccne1，Ccnd1，Ccne2，Ccnd2）和HCC诊断标志物（Afp，Spp1）呈正相关，表明这些脂质对于HCC增殖状态的重要性。
作者对人类HCC肿瘤进行了RNA测序，以确定是否还会发现相似的相关性。对三组PC（SFA，MUFA，PUFA）和相关脂质基因进行了Spearman秩相关分析，其基因表达与HCC和增殖的已知marker有关（图6A）。与DEN / HFD模型相似，与含有SFA和PUFA的PC相比，我们发现了肿瘤中MUFA-PC的独特关联。由于，MUFA-PC与ACLY，ACACA，ELOVL6，SCD和ACSL4的基因表达呈正相关，可能与脂质所涉及到的途径有关，SFA-PC与LAMB1，ICAM1，TGFB1（EMT的标记以及其他功能）和CCND2呈正相关。此外，MUFA-PC与增殖和细胞周期标志物（CCNE2，CCNA2，CCNB2，PCNA，MYC）的表达以及几种HCC临床诊断和/或预后标志物（例如AFP，SPP1）相关（图6A，图6B）。
以上数据表明，HCC中肝细胞的增殖可能与以下方面有关：i）增强新生脂肪形成；ii）SCD介导的脂肪酰基链去饱和增加；iii）降低α-氧化；iv）通过CDP-胆碱途径增加PC的合成。通过以上可能的机制，进而增加MUFA-PC的含量。
图6 MUFA-PC与人肝细胞的增殖，细胞周期和标志物相关
结论
越来越多的证据表明，细胞代谢的调制可能是改善癌症细胞增殖的优良策略。弄清癌细胞中发生的复杂代谢过程是非常重要的，这会向我们传递新的药理学靶点和潜在的诊断或预后生物标志物。在这里，作者首次展示了一个集成的系统生物学数据集（脂质、水代谢物和RNA测序），研究了肝再生、肝增生以及鼠和脂肪肝相关人类HC等的多种模型中脂质代谢的重编程。
镇静催眠药处理的小鼠肝甘油三酯含量显著高于其他组，相比于正常饲料喂食，高脂饮食引起短链甘油三酯的增加。这突出了在HCC中，肝代谢中饮食特定的变化。重要的是，还识别出增殖的肝细胞中血脂代谢的变化，是独立增殖活动及微环境的影响。
在所有模型中，均观察到MUFA-PC的增加。通过整合脂质组学、代谢组学和转录组的数据，将脂质含量的变化与特定途径联系起来，包括增加脂生成、脂肪酸度脱饱和、PC脱氧合成、PC重塑和酸度降低。此外，还发现MUFA-PC水平与小鼠和人体肿瘤中的增殖标记、细胞周期控制等遗传标记密切相关。脂质中增加的MUFA可能给高增殖的癌细胞带来益处，如防止棕榈酸的积累，从而避免触发内质网应激和凋亡信号通路激活。据研究，饱和磷脂的减少会改变HCC细胞的膜流动性，进而改善葡萄糖的摄入和增加的转移能力。减少PUFA有助于增殖细胞通过磷脂酶作用促进异丙酮的产生，从而促进细胞生存和增殖程序的启动。与非肿瘤组织相比，在HCC中观察到的血浆成分的减少，这些脂质被认为对氧化损伤起着保护作用，循环血浆蛋白的减少也被证明与HCC和2型糖尿病有关。
靶向脂质代谢正日益成为HCC新的治疗策略，越来越多的证据表明，抑制脂肪酸的去饱和和延伸是抑制脂质合成的有效方法。作者研究表明，多种脂质相关代谢基因的丰度变化与人类HCC的进展有关，需要进一步研究以评估其作为药物靶点的潜力。由于肝MUFA-PC与HCC的增殖和其他标记密切相关，这将进一步可能成为新的预后标记
评论
原文网址：https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/hep.31391