科研 | Nature子刊：限制性饮食可改变脂质和氨基酸代谢产物的节律性，但不会扰乱生物钟基因的表达
编译：Echo，编辑：Tracy、江舜尧。
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限制性饮食（Time-restricted feeding, TRF）独立于饮食营养元素和能量限制来改善代谢。为了阐明短期TRF作用的机制，作者研究了TRF（每天进食8h）和延长饮食（Extendedfeeding, EXF）（每天进食15h）11名超重/肥胖男性的骨骼肌、血清代谢和转录组特征。研究表明肌肉核心时钟基因表达在两种干预后的结果是相似的，TRF可以增加肌肉转录本的振幅，但对肌肉或血清代谢物的振幅无明显影响。在肌肉中，TRF会诱发一些氨基酸转运基因和代谢物的节律性。在血清中，脂类是最大的一类周期性代谢物，然而相位偏移代谢物的主体与氨基酸密切相关。总之，短期的TRF在超重男性中影响血清和肌肉代谢物的节律性，并调节控制氨基酸转运基因的节律性，但核心时钟基因的表达并没有发生明显改变。
论文ID
实验设计
实验结果
1. TRF影响代谢产物和转录的周期性
图1. 样本的降维和周期特征
基于骨骼肌基因的样本主成分分析(PCA) (a)、骨骼肌代谢物(b)和血清代谢物(c)，颜色表示不同的采样时间，圆形表示延长喂料(EXF)，三角形表示限时喂料(TRF)，EXF (d)和TRF (e)后骨骼肌中周期性转录本的t-SNE聚类，EXF (f)和TRF (g)后骨骼肌的周期代谢物，EXF (h)和TRF (i)后血清代谢物，n = 11名参与者。
2. 周期性代谢物和转录产物的重叠
作者确定了TRF条件下1609个骨骼肌节律变化的转录本，在EXF条件下有615个，其中582个在两种情况下共有(Fig.2a)。TRF在骨骼肌中诱导了33种独特的周期性代谢物，而EXF在骨骼肌中诱导了23种独特的周期性代谢物，两种情况共有8种代谢物重叠(Fig.2b)。作者在TRF和EXF条件下发现有115和86个代谢物具有独特的周期性，有157个代谢物在这两种情况下具有相同的周期性(Fig.2c)。比较骨骼肌和血清中的周期性代谢物发现，最大的一组(131个代谢物)在EXF和TRF之间的血清中基本一致，有6个常见代谢物在整个进食模式中的骨骼肌和血清中表现出节律性(Fig.2d)。在骨骼肌和血清的比较中，研究人员发现EXF后有3种独特的代谢产物，TRF后有5种独特的代谢产物(Fig.2d)。
图2. 血清和骨骼肌中显著周期性特征的重叠
周期性骨骼肌转录本(a)，骨骼肌代谢物(b)，延长喂养后的血清代谢物(EXF)灰色(c)，限制性饮食(TRF)淡红色。周期性的血清和骨骼肌代谢物的比较(d)。竖条表示集合大小，点和线表示集合身份，n = 11名参与者
3. 周期特性的节律性特征
TRF后骨骼肌转录本显示出一个虽然很小但显著的差异。尽管不同进食模式之间高峰期分布的总体格局具有可比性，但大多数转录本在EXF的15：00达到峰值，TRF的23：00达到峰值(Fig.3a)。骨骼肌代谢物具有相似的幅值和中值分布，大多数代谢物在EXF的11:00和TRF的03:00达到峰值(Fig.3b)。血清代谢物在振幅或者中值方面并没有明显差异，但在EXF和TRF后均展现出双峰分布。
图3. 周期特征的振幅和峰值分布
各条件下周期特征的密度图，显示振幅、中值和峰值，黑线代表延长喂养(EXF)，红线代表限制性饮食(TRF)；骨骼肌转录本(a)，骨骼肌代谢物(b)和血清代谢物(c)。
4. 代谢物的节律失调
每个参与者的相对昼夜节律校准(相位调整到皮质醇)表明，与EXF相比，TRF诱导骨骼肌代谢物的相位提前，在血清中观察到相反且较小的差异(Fig. 4a)。比较不同进食模式之间的骨骼肌转录物或代谢物的高峰期时，这些特征中的大多数都有相似的峰值时间。然而，少部分骨骼肌转录本和代谢物在TRF与EXF中有4小时的相位提前。相反，比较血清代谢物时，大致相同数量的特征在TRF与EXF中表现出峰值时间不变或相位提前4小时(Fig. 4b)。
图4. 周期性特征的昼夜节律校准
密度图显示骨骼肌(上)和血清代谢物(下)与所有个体皮质醇最大值相比较的相对相位移动，黑线表示延长喂食(EXF)，红线表示限制性饮食(TRF)(a)，骨骼肌转录本特征水平上TRF相对于EXF相移的直方图(b)。
5. 骨骼肌核心时钟基因振荡
骨骼肌核心时钟基因ARNTL、CLOCK、CRY1、DBP、NPAS2，REVERB alpha，REVERBbeta, PER1, PER2和PER3在两种进食模式后都表现出周期性振荡，而CRY2和RORA对任何一种干预都没有表现出周期性振荡(Fig. 5a)。对于任何一个核心时钟基因，在中值、振幅或峰值在两种进食模式之间没有显著差异。皮质酮、皮质醇和可的松在两种进食模式后均表现出显著的周期性，但在中值、振幅和峰值方面没有显著差异(Fig.5b)。
图5 生物钟装置的周期性
骨骼肌核心时钟基因(a)和血清糖皮质激素(b)的表达。黑线色表示延长喂养(EXF)，红线色表示限制性饮食(TRF)。
6. 周期特征的功能富集分析
骨骼肌中周期性基因的GO富集分析表明，两种进食模式都导致转录活性调控相关编码基因的周期性振荡。EXF诱导编码调控转录因子活性和蛋白磷酸酶活性的基因振荡，而TRF诱导编码组蛋白去乙酰化活性、转录调控和一元羧酸转运蛋白活性的基因振荡。EXF和TRF均能富集有机酸和羧酸跨膜转运蛋白相关基因(Fig. 6a)，EXF后骨骼肌代谢产物富集了脂肪酸代谢，而TRF后富集了亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸代谢产物(Fig.6a)。在EXF后血清代谢产物富集了多不饱和脂肪酸，而TRF后富集了脂肪酸代谢(Fig. 6a)。在EXF或TRF后，脂类是血清中最大的周期性代谢产物(Fig.6b)，而骨骼肌代谢产物的主要类型分别是脂类和氨基酸(Fig. 6b)。氨基酸相关代谢物在两种进食模式富集在21：00和EXF后的03：00，能量相关代谢物在EXF后17：00富集(Fig.6c)。
图6 周期特征的功能性富集分析
骨骼肌周期性转录本分子功能的表达分析(上图)、延长喂食(EXF)和限制性饮食(TRF)后骨骼肌代谢物(中图)和血清代谢物(下图)子通路的确立比例。颜色表示FDR校正后的p值；圆的大小表示周期基因的比例(a)，EXF和TRF后骨骼肌和血清中周期代谢物超级通路确立的比例(b)，EXF和TRF后每个测量时间点骨骼肌和血清中周期代谢物超级通路的数量(c)。
7. EXF和TRF之间周期性的差异
EXF和TRF可诱导许多转运体编码基因的节律性，除此之外TRF又可诱导几种氨基酸转运体节律性(Fig.7a)。中值、波幅和峰值的差异分析显示，大多数血清差异代谢物的峰值发生了改变，其中33个代谢物仅在峰值不同，6个仅在中值不同，8个仅在振幅不同(Fig. 7b)，不同峰值或者中值的血清代谢物大多与氨基酸相关，而振幅不同的血清代谢物大多与脂类相关(Fig.7c&d)。EXF可诱导血清代谢物的振幅升高，氨基酸的中值升高和脂质相关代谢物的中值降低(Fig.7d)。不同的节律基因参与RNA加工和PI3K调节，大多数基因具有不同的峰值和振幅，而不是中值。
图7 转运体的周期性、差异转录物和血清代谢物的节律性
在EXF和TRF富集出来的转运体注释基因的热图(a)，在峰值、振幅或中值有显著差异的血清代谢物(b)，EXF和TRF中具有不同峰值的血清代谢物热图(c)，在振幅方面有显著差异的血清代谢物散点图(d)，FDR校正后的p值具有显著差异的基因表达，无论是源于CircaCompare的振幅(#)还是峰值(+)(e)。
讨论
转录过程的昼夜节律调节影响细胞代谢和稳态，能量摄入的时间和成分深刻影响外周组织的昼夜节律。确切地说，营养上的负载是如何被不同的组织特异性时钟所驱动，仍然在很大程度上是未知的。在这里，作者研究了超重/肥胖男性的骨骼肌转录组、血清和骨骼肌代谢物，以确定如何限制食物摄入的时间窗(15-8h/天)带来的一些代谢健康的益处。在这个队列中，短期TRF降低了夜间血糖水平，改善了一整天的胰岛素状况。24小时血清和骨骼肌的连续采样提供了血清和人体骨骼肌日变化代谢组的对比分析，这对于破解那些构成不同营养负载的特定代谢信号循环代谢物至关重要。研究人员证明了TRF影响血清和骨骼肌代谢物的节律性，并且强调了氨基酸转运蛋白基因的节律性，以及氨基酸和脂质代谢物，并且不干扰核心时钟基因的表达。
PCA显示无论是进食模式还是采样时间都没有明确的样本聚类，这意味着观察到的系统生物变异不受基因表达或代谢物含量协调周期变异的主导。这表明出了TRF对人体代谢有潜在的影响，这一发现可以用整体周期变化的骨骼肌转录本和代谢物的低比率、以及EXF或EXF后血清代谢物特征的相似性来支持。相反，对骨骼肌转录物与骨骼肌和血清代谢物的相似性分析显示，基于峰值时间有明显的聚类，表明计算出的周期变化转录本和代谢物的峰值间接预测了其节律变化的模式。新陈代谢昼夜节律调节的一个基本模式是基因表达的振荡产生细胞新陈代谢的每日节律，然而，并不是所有的周期振荡都在核心时钟机制的控制下。例如，红细胞的代谢活动可以是周期性的，独立于核心时钟机制。此外，TRF可以改善高脂肪喂养的缺乏生物钟的肥胖小鼠的葡萄糖稳态。
在多种代谢损伤下，核心时钟基因振荡的一致性显示了昼夜节律钟系统的弹性。然而，伴随振荡的失去与得到或者相位和振幅的改变，代谢时钟输出基因(其中一些是转录调节基因)往往表现出更深刻的变化。我们发现两种进食模式的周期性转录本数量有很大差异，这与之前报道中的昼夜节律转录物数量总体保持一致，但骨骼肌中核心时钟基因的表达没有差异，也没有昼夜节律激素、皮质醇、可的松和皮质酮的差异。在啮齿类动物中，TRF可以增加肝脏的节律幅度和昼夜节律基因以及时钟输出基因的表达，此外TRF对高脂喂养的小鼠肝脏代谢产物的影响更大。研究人员发现TRF增加了骨骼肌转录本的振幅，但没有增加骨骼肌或血清的代谢物；相反，研究人员发现大多数差异周期血清代谢物振幅降低。TRF和EXF两者之间常见的周期性转录产物和代谢物可以代表基本的代谢过程，具有12小时昼夜节律周期的转录本显示了转录活性的富集以及对PI3K调节活性的富集。此外，具有不同节律性的转录本参与了RNA加工处理和转录调控以及PI3K/AKT信号通路。在TRF和EXF之后转运蛋白活性相关的基因都得到了富集。值得注意的是，一些氨基酸转运蛋白只有在TRF后才有周期性。研究人员发现，在TRF或EXF后检测到大多数周期性的血清代谢物是脂质；然而，在EXF和TRF之间具有明显峰值差异的代谢物和骨骼肌TRF条件下绝大多数的周期性血清代谢产物是与氨基酸相关的。总的来说，研究人员的结果表明TRF在代谢组上引起了一天的特异性反应，包括从血清中氨基酸摄取的增加和骨骼肌中氨基酸代谢的增加。
目前的研究有几个优点和局限性，虽然有几项研究表明了餐后血清代谢的情况，但本文的研究表明了自由的生活和昼夜节律，同时也具有潜在的临床转化价值。此外，作者还运用血清代谢物分析，评估了不同进食模式对骨骼肌作为全身重要的代谢调节器官代谢物和转录组的影响。通过交叉设计本文的样本量得到了改善，包括了4天的协调期，并且在此期间受试者被监测饮食依从情况，从而最小化个体变异的混杂效应。值得注意的是，该研究设计的目的并不是捕获被诱导的昼夜代谢产物和转录本，相反，其目的是识别有效的日变化代谢物和转录物。虽然本文进行了非靶向代谢物分析，但检测到大多数代谢物的身份仍需要进一步确认，研究人员无法在分析中充分捕捉到人类代谢物的大量多样性。未来更广泛的代谢物图谱研究将使我们能够努力描绘生物体对代谢紊乱的日变化反应。
总之，本文已经使用转录组学和非靶向代谢组学来表征血清和骨骼代谢特征，以应对等能的时间限制和延长进食的受控干预。作者提供的证据表明，短期TRF调节脂质和氨基酸代谢的昼夜节律，而不调节骨骼肌核心时钟基因的表达。长期的研究时间限制和延长进食在人类的真实世界设置，需要使用有针对性的技术来确定TRF对健康有益的精确机制。