由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 引起的2019年冠状病毒病 (COVID-19) 已发展成为全球大流行病，迄今为止只有少数抗病毒治疗获得批准。血管紧张素转换酶2 (ACE2) 在SARS-CoV-2发病机制中起着重要作用，因为它允许病毒进入宿主细胞。近日，北卡罗莱纳州立大学程柯教授课题组在Nature Nanotechnology杂志上发表文章，报道了源自人肺球状细胞 (LSC) 的ACE2纳米诱饵（nanodecoys）可以结合和中和SARS-CoV-2，并保护宿主肺细胞免受感染。在小鼠中，这些LSC-纳米诱饵通过吸入疗法递送，并在递送后在肺部停留超过72小时。此外，吸入 LSC-纳米诱饵加速了SARS-CoV-2模拟物从肺部的清除，没有观察到毒性。在用活SARS-CoV-2攻击的食蟹猴中，四剂这些通过吸入递送的纳米诱饵促进了病毒清除并减少了肺损伤。研究结果表明，LSC-纳米诱饵可以作为治疗COVID-19的潜在治疗剂。血管紧张素转换酶2（ACE2）存在于许多细胞类型中，且几乎存在于所有组织中，是一种羧肽酶，在病毒进入宿主细胞中起关键作用。SARS-CoV-2通过其刺突蛋白与ACE2的相互作用，特异性攻击肺部中呈递ACE2的II型肺细胞和鼻粘膜中的杯状分泌细胞。该研究利用病毒的细胞进入策略作为特洛伊木马来欺骗病毒。在过去的七年里，作者的实验室已经开发出肺球状细胞 (LSC) 作为治疗肺纤维化和炎症的细胞疗法，从最初的啮齿动物研究做到了正在进行的1期临床试验(NCT04262167)。LSC是常驻肺上皮细胞（包含I型和II型肺细胞）和间充质细胞的混合物。作为常驻肺细胞，它们表达ACE2，因此作者制造了LSC膜纳米囊泡作为ACE2纳米诱饵。这些作为细胞模拟物的LSC-纳米诱饵能够与SARS-CoV-2刺突(S)蛋白结合并触发巨噬细胞的吞噬反应，从而消除病毒。人们已经开发出治疗性抗体和融合抑制剂来靶向SARS-CoV-2的刺突蛋白。然而，已经发现了与SARS-CoV-2刺突蛋白突变相关的更具攻击性的变异。因此，基于病毒用来进入宿主细胞的人类受体ACE2而非病毒成分的抗病毒策略应该引起更大的兴趣，因为预计宿主细胞不会发生突变。作者的研究数据支持中和SARS-CoV-2的潜在非侵入性治疗策略。该方法与目前使用的两种策略（抗病毒药物和疫苗）有根本不同。用于制造纳米诱饵的LSC是通过稳健、可重复和可扩展的培养方法产生的，适用于生产临床适用数量的细胞治疗产品。此外，这种纳米诱饵技术具有高度的可转化性，因为亲本细胞目前处于早期临床试验阶段，作为肺纤维化的潜在治疗方法。补充图1、从肺球体细胞产生纳米诱饵和用于SARS-CoV-2感染的纳米诱饵疗法的示意图该研究的纳米诱饵设计的总体原理如上面补充图1所示。首先，针对ACE2表达筛选LSC及其亲本细胞、肺外植体衍生细胞 (EDC)，以确定纳米诱饵制造的最佳细胞类型。通过免疫染色、免疫印迹和流式细胞术分析LSC和EDC的ACE2表达。此外，使用免疫印迹和流式细胞术作为对照研究了HEK293和人肺成纤维细胞的ACE2表达水平。发现LSC的ACE2表达水平高于其他细胞类型，包括它们的母细胞EDC。相比之下，HEK293和成纤维细胞的ACE2表达明显较低。先前的研究表明，肺组织中83%的表达ACE2的细胞是II型肺细胞，这表明肺是SARS-CoV-2病毒最脆弱的靶器官。因此，结果表明，作为原代肺细胞，LSCs可能是产生具有高水平ACE2表达的纳米诱饵的理想细胞类型。相比之下，HEK293细胞可被用作制备具有低水平ACE2表达的纳米诱饵的对照。LSC和HEK293膜纳米囊泡(nanodecoys)是通过将LSC或HEK293细胞连续通过孔径为5 μm、1 μm 和最终0.4 μm的聚碳酸酯膜商用挤出机挤出产生的。获得的LSC-nanodecoys通过纳米粒子追踪分析进行表征，结果表明由5 × 106个细胞产生的均匀纳米粒子群平均大小为320 nm，平均浓度为5.51 × 1010粒子ml-1（图 1e）。换句话说，平均而言，一个LSC产生了11,020个纳米诱饵。由于使用全细胞制备纳米诱饵，作者怀疑纳米诱饵不仅由质膜产生，也由细胞内膜产生。为了证实该假设，作者还通过检测了Alix和 Calnexin来研究纳米诱饵的细胞内成分。结果显示检测到这两种细胞内标记，这支持了该假说（图 1f）。流式细胞术分析证实了ACE2（图 1g）以及 II 型肺细胞标记物SFTPC（图 1h）保留在纳米诱饵表面。此外，通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 研究了LSC和HEK293细胞及其纳米诱饵上ACE2 的数量。ACE2的丰度被确定为每个LSC有2.1 × 106个受体，每个LSC-nanodecoy有112个受体。与此形成鲜明对比的是，在每个HEK293细胞和HEK-nanodecoy上分别发现仅3.4 × 105和10个ACE2受体（图 1i）。此外，透射电子显微镜（TEM）图像揭示了纳米诱饵的球形形态（图 1j，k）。
COVID-19灵长类动物模型中的纳米诱饵疗法
在证实纳米诱饵可对刺突蛋白S1发挥中和作用、在体外对 SARS-CoV-2模拟病毒起中和作用、检测吸入后纳米诱饵的生物分布、证明纳米诱饵吸入可加速清除小鼠模型中SARS-CoV-2模拟病毒后，作者进行了一项试点非人类灵长类动物研究，以评估LSC-纳米诱饵的安全性和初步治疗效果。食蟹猴模型可以概括SARS-CoV-2感染的许多临床症状，并在上呼吸道和下呼吸道显示出强大的病毒复制。六只食蟹猴通过鼻内和气管内途径感染SARS-CoV-2（图6a）。感染后，将动物随机分为两个治疗组：在感染后第2、3、4和5天吸入PBS或LSC-纳米诱饵（剂量为每公斤体重1010个粒子）。支气管肺泡灌洗液 (BAL) 和鼻拭子 (NSs) 中的病毒载量通过实时PCR对病毒亚基因组RNA (sgRNA，指示病毒复制)进行评估。结果，在对照动物中观察到高水平的sgRNA，BAL中的中值峰值为6.243log10 RNA 拷贝ml-1，第2天NSs中每个拭子的中值峰值为5.595 log10 RNA拷贝（图 6b,c）。在纳米诱饵处理的动物中，sgRNA水平显著降低，在感染后第8天，BAL和NSs中 sgRNA 的中值峰值降低到<1.70 log10。尽管对照和LSC-nanodecoy组的sgRNA水平随时间下降，但LSC-nanodecoy治疗诱导了更快速的病毒清除。有趣的是，LSC-nanodecoy组的温度和体重波动并不像对照组动物那样剧烈。
图6、LSC-nanodecoy吸入治疗食蟹猴的SARS-CoV-2感染该研究在活体SARS-CoV-2感染的非人类灵长类动物模型中提供了证据，表明细胞衍生和细胞模拟纳米诱饵可以保护肺细胞免受SARS-CoV-2引起的感染和损害。食蟹猴模型概括了人类COVID-19患者的许多临床特征。在SARS-CoV-2感染后8天，四剂纳米诱饵吸入导致BAL和NS中的病毒载量减少。未观察到体重减轻、发热或死亡等不良事件。肺组织的组织病理学、免疫组织化学、RNAscope和免疫荧光分析表明，纳米诱饵不仅能有效减轻炎症细胞浸润和减少肺纤维化，更重要的是，能够降低SARS-N和vRNA的水平。因此，该研究结果表明，LSC-nanodecoys可以作为治疗COVID-19的潜在治疗剂。LiZ, Wang Z, Dinh PC, Zhu D, Popowski KD, Lutz H, Hu S, Lewis MG, Cook A,Andersen H, Greenhouse J, Pessaint L, Lobo LJ, Cheng K. Cell-mimickingnanodecoys neutralize SARS-CoV-2 and mitigate lung injury in a non-humanprimate model of COVID-19. Nature Nanotechnology. 2021Jun 17. PMID: 34140674.
