精准医学：深度MRD分析明确了低危和高危骨髓瘤的预后并揭示了不同的治疗耐药模式｜治疗研究
易点评
血液肿瘤的治疗已进入个体化精准治疗时代。然而，如何对肿瘤细胞或克隆进行精准的监测、何时采取预防或早期的干预措施，仍是待解决的问题。而这一问题的关键，在于寻找简便、可靠的可作为微小残留病（MRD）检测的标志物与检测手段。传统细胞形态学的检测灵敏度是可以检测5%的肿瘤细胞，普通流式检测的灵敏度达到10-4，数字PCR检测技术，NGS深度测序等这些分子检测技术灵敏度更高，特异性更好，满足了对灵敏度的要求。本文则展示了一种EuroFlow公司开发的下一代流式技术在骨髓瘤中检测MRD的应用案例。在临床上虽然低危细胞遗传异常(CA)的多发性骨髓瘤(MM)患者与高危CA MM患者拥有相似的缓解(CR)率，但高危CA MM患者往往预后较差。因此，临床上就CR能否作为判定高危多发性骨髓瘤治疗终点的标准提出了质疑。在本文中，作者使用Next-Generation Flow(NGF)技术来评估低危CA和高危CA MM患者的MRD。同时，还对MRD肿瘤细胞进行了全外显子测序，发现低风险CA患者拥有更多的克隆选择。本文对MRD的深入研究也为治疗耐药性分子机制的研究提供了新的思路。
背景
多发性骨髓瘤(MM)是第二大常见的血液系统肿瘤，其临床异质性很强，一些患者的存活率很低，而另一些患者是可以治愈的。多发性骨髓瘤病程的变化促使人们寻求个体化治疗以达到疗效最大化的目的，但目前为止，患者治疗方案的选择主要是基于临床因素(例如：年龄和并发症)。
细胞遗传异常(CA)在MM中具有十分重要的预后价值。因此，国际骨髓瘤研究机构更新了国际分期系统(ISS)，将乳酸脱氢酶(LDH)和细胞遗传异常(CA)结合起来，在新的分级系统中t(4；14)，t(14；16)和del(17p13)在多个临床试验中被选评高危CA。一些研究发现，标准CA和高危CA患者对治疗同样敏感，而高危CA患者在与低危CA患者拥有相似的完全缓解率(CR)的情况下生存率却较低，这是一个无法解释的临床悖论。这使得临床上对CR作为判定高危多发性骨髓瘤治疗终点的合理性提出了质疑。
越来越多的证据证明可以根据可测量残留病(MRD)进行风险分层来取代传统的分级标准。作者研究发现，对CA、MRD的高敏感性评估有助于解决临床风险分层的异质性问题：MRD的持续存在缩短了标准风险患者的生存时间，而无法检测到的MRD减少了高危MM的不良预后。进一步使用Next-Generation Flow(NGF)分离MRD，然后对诊断和MRD肿瘤细胞进行全外显子和RNA测序，分析结果显示标准风险MM患者在ROS介导的耐药性中有更多的克隆选择性。
结果
MRD的无法检出解决了高风险CA患者存活率低的问题
研究发现，尽管高危MM患者未检出MRD的比率较低，但标准CA患者和高危CA患者的持续MRD检出阴性的百分率仍相似(分别为71/300[24%]和17/90[19%])。这可能表明，高危CA患者无法检测到的MRD数量的降低会预示着良好的治疗效果。在不能检测到MRD的患者中，36个月的PFS率高于90%，并且在标准CA和高危CA之间没有显著差异(分别为91%和97%；图1A)，在有关OS的调查中也发现了类似的结果(图1B)。相比之下，持续检出MRD则会使标准CA和高危CA患者36个月的PFS率显著降低(分别为60%和37%)。与那些未检测到MRD的患者相比，两个患者亚组的OS也明显较差(36个月OS率分别为82%和52%)。
图1
治疗手段导致在标准多发性骨髓瘤中的MRD肿瘤细胞拥有更多的克隆选择
作者根据患者特定的异常表型利用NGF技术来检测和分离MRD肿瘤细胞，以便后续对配对诊断和VRD诱导后存在的肿瘤细胞进行外显子测序(N=14)。测序结果表明，在两个处理中检测到了308/772(40%)突变和48/67(72%)的突变。在分析过程中作者发现，每当在MRD肿瘤细胞中检测到KRAS、BRAF、CCND1或ROS1等基因的潜在可操作突变，在MRD分期中就无法检测到NRAS或FLT3等基因的其他突变。有趣的是，标准风险MM患者的MRD肿瘤细胞的大多数突变无法检测到，而高危CA患者在治疗后出现了更多的新突变位点。这些发现揭示了标准风险多发性骨髓瘤(图2)患者可以拥有更多的克隆选择，而潜在的基因组不稳定性可能促进了高危CA患者从治疗中获得了更多的MRD肿瘤细胞新突变。
图2
高危CA患者MRD肿瘤细胞中抗氧化基因表达上调
当作者比较标准(N=26)和高危(N=14)CA患者接受VRD诱导后存在的诊断肿瘤细胞和MRD肿瘤细胞的转录图谱时，发现前者MRD肿瘤细胞中差异表达的基因数量几乎是后者的2倍(图3A)。此外，基因集富集分析显示，标准多发性骨髓瘤和高危多发性骨髓瘤的调控通路发生了改变(图3B)。
接下来，作者评估了抗氧化基因的表达是否能够用来识别新诊断的多发性骨髓瘤患者，这些患者富含能够对抗ROS诱导的细胞毒性的肿瘤细胞。如果假设正确，这些患者在接受以bortezomib为基础的治疗方案时将会有较差的治疗效果。在对MRD肿瘤细胞中ROS途径特异性富集的20个基因的多变量分析中发现，SOD1和PRDX6的表达水平与PFS的相关性最强。也就是说，SOD1和PRDX6的表达量增加导致了高危CA患者的PFS显著降低。
图3
MRD克隆的转录图谱
为了研究MRD耐药性的机制，在不考虑细胞遗传学的前提下，作者比较了所有患者(N=40)在VRD诱导后持续存在的诊断克隆和MRD克隆的转录图谱。分析发现762个基因显著差异表达(图4A)，包括IL8和CHI3L1的过量表达，这些基因与MM的耐药性和预后不良有关。与其他部分应答非常好的患者相比，从诊断时的肿瘤细胞到MRD肿瘤细胞的差异表达基因数量更多。功能网络富集分析显示，与RNA剪接、蛋白酶体活性通路相关的基因表达下调(图4B)。这说明，少数经过治疗后可以检测到的肿瘤细胞中含有一个与耐药性相关的转录程序。
图4
结论
除了一些作者的发现的临床意义之外，这篇文章对MRD的深入探索可以为治疗耐药性分子机制的研究提供新的思路。如果针对MRD的靶向治疗能够诱导更多未被检测到的MRD的出现，这对于延长标准和高危MM患者的生存期将是至关重要的。