科研 | Plant Cell Physiol：互花米草的全长转录组揭示了单子叶植物高耐盐性分子机制（国人佳作）
编译：Jerry，编辑：十九、江舜尧。
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互花米草Spartinaalterniflora(Spartina)是盐沼中唯一的盐生植物。然而，其高耐盐性的分子基础至今未知。本研究采用基于PacBio平台的实时单分子测序和RNA-seq测序，通过盐梯度实验研究了互花米草高耐盐性的转录组动态，并从中鉴定出高质量的unigene、转录因子、非编码RNA和互花米草特异性转录本。共表达网络分析发现，编码SaOST1、SaCIPK10和SaLRRs的蛋白激酶是耐盐调控网络中的枢纽基因。高盐胁迫诱导转录因子表达，但抑制长非编码RNA的表达。与拟南芥相比，互花米草的转录组更接近水稻，在互花米草中发现了较高比例的转运体和转录因子。转录组分析表明，高盐胁迫诱导了互花米草碳水化合物代谢，特别是细胞壁生物合成相关基因的表达，同时抑制了水稻碳水化合物代谢相关基因的表达。与水稻相比，高盐胁迫对互花米草的胁迫反应、蛋白质修饰和氧化还原相关基因的表达有较强的诱导作用，而对其翻译有较强的抑制作用。高盐胁迫也诱导了互花米草的选择性剪接，而与光合作用相关的差异表达的选择性剪接事件在互花米草中很常见，而在水稻中则没有。最后，我们建立了SAPacBio网站，用于互花米草的全长转录组序列、转录因子、非编码RNA、耐盐基因和选择性剪接事件的可视化分析。总的来说，本研究表明，互花米草的耐盐机制在许多方面与水稻不同，远比预期的复杂。
论文ID
原名：The Full-Length Transcriptome of Spartina Alterniflora Reveals theComplexity of High Salt Tolerance in Monocotyledonous Halophyte
译名：互花米草的全长转录组揭示了单子叶植物的高耐盐性分子机制
期刊：PLANT AND CELL PHYSIOLOGY
IF：3.929
发表时间：2020.02
通讯作者：Xiaohui Wu & Liuyin Ma
通讯作者单位：复旦大学自动化系和福建农林大学基础林业与蛋白质组学研究中心
DOI号：10.1093/pcp/pcaa013
结果
1 互花米草全长转录组的鉴定
研究者使用PacBio-SMRT测序法获得了互花米草高置信度的全长参考转录本，以避免由于其复杂的六倍体基因组（2n=6x=62）而产生的潜在偏差。实验过程的概述如图1所示。简单地说，用0、350、500和800 mM NaCl处理6周龄的植株24小时，分别模拟无盐胁迫、低盐胁迫、中盐胁迫和高盐胁迫条件。从不同盐胁迫条件下的植株中分离总RNA，并将其均匀混合，构建三个不同长度的cDNA文库（1-2kb、2-3kb和>3kb）。在PacBio-RSII测序平台上对7个SMRT cell进行测序。每个文库中的插入片段的长度分布与所选择的大小一致（图2A）。
通过SMRT进行质量控制和数据纠错软件proovread对2.5亿转录组测序序列进行进一步纠正后，共获得179194个FLNC序列（全长非嵌合序列，即两端同时含有3’引物和5’引物，及3’引物前含有polyA尾的非人工嵌合序列），其中90587个是非冗余FLNC。超过90%的FLNC转录本含有平均编码序列（CDS）长度为1601bp的开放阅读框（ORF）。这些FLNC转录本涵盖了多种功能注释，如催化活性、代谢过程和转运体活性（图S1）。这些转录本进一步被组装成24670个unigene。其中，55.73%含有多种可变剪切体（图2B），其百分比与之前的研究相当。我们进一步比较了来自PacBio的FLNC转录本和来自RNA-seq的数据。FLNC转录本的平均长度（2405bp）明显长于RNA序列数据（324bp）。超过73%的RNA-seq contigs可以被映射到FLNC转录本，而64755个FLNC转录本是新发现的，不存在于RNA-seq数据中（图2C）。总的来说，PacBio-FLNC转录本提供了合格的全长参考序列，以全面分析互花米草转录组。
图2 互花米草全长转录体的特征。（A）每个片段大小一定的文库中插入片段（ROI）长度分布。（B）不同剪切体支持的独特转录簇的分布。（C）从RNA-seq和PacBio数据中鉴定的转录本的比较。RNA序列数据从头组装的Contigs（Bedre等人，2016）被映射到PacBio全长转录本（FLs），反之亦然。nContigs：根据RNA序列数据重新组装的contigs的数目；nQ：映射到PacBio FLs的contigs的数目；pQ：映射到FLs的contigs的百分比；nS：映射到contigs的FLs的数目；pS：映射到contigs的FLs的百分比。（D）利用BLAST（e值<1e-5）对互花米草和水稻以及拟南芥的FLNC转录本进行序列相似性分析。
2互花米草和水稻、拟南芥的全基因组比较
由于互花米草是一种单子叶盐生植物，检测了它的转录物是否与其他植物同源。为此，将互花米草的FLNC转录本比对到拟南芥和水稻。只有不到9%的转录本被比对到拟南芥上，而超过80%的转录本与水稻中的转录本高度相似（图2D）。这些结果表明，互花米草与单子叶作物水稻高度同源。
为了解互花米草与其他植物物种之间的潜在差异，通过分析不同GO term中基因的比例来分析水稻、拟南芥和互花米草的差异。通过Blast2GO发现有19,093个unigene能被GO注释到，使用AgriGO发现拟南芥有30,821个unigene能被GO注释，而水稻有30,241个unigene。详细分析表明，与水稻和拟南芥相比，在“转运体活性”功能项下，互花米草中的基因更多（互花米草为6.6%拟南芥为4.6%，水稻为4.8%，而在互花米草和拟南芥之间Fisher检验p值为2.06e-20，互花米草和水稻之间Fisher检验p值为7.19e-17）（图3）。这一差异表明，水稻的转运基因扩展可能是其耐盐表型的一个解释。
图3 比较互花米草、水稻和拟南芥在不同GO term中的基因比例。这三个物种的带注释基因或unigene的Blast2GO结果被映射到GO term的第二级分类中。p值使用Fisher精确检验计算，**表示p值低于0.01，而*表示p值介于0.01和0.05之间。
3 盐胁迫下互花米草全基因组基因表达谱的动态变化
为了鉴定响应盐胁迫的转录本并探讨其耐盐机制，以4种盐胁迫梯度下生长的互花米草全株为材料，构建了12个RNA-seq文库。由测序结果可知，盐胁迫下，表达上调的unigene的量远大于下调的unigene的量，特别是在高盐胁迫下，表明高盐胁迫显著诱导了互花米草转录本的表达。
为了筛选得到与高盐胁迫相关的unigene，将高盐处理（800 mM NaCl）与空白对照组之间的差异表达 unigenes进行代谢通路的富集分析。其中表达量上调的unigenes主要富集到离子转运、应激反应和氨基酸代谢过程等代谢通路，而光合作用和翻译在表达量下调的unigenes中显著富集。重要的是，这些代谢途径是植物盐胁迫响应机制的关键组成部分，表明高盐胁迫也极大地影响了互花米草盐反应途径的基因表达。
为验证高盐胁迫相关的unigene，随机选取15个差异表达 unigenes进行qRT-PCR实验。qRT-PCR检测的相对表达量与RNA-seq显著相关（皮尔森相关系数=0.713，p值=3.908e-08，图4D）。
4共表达网络分析揭示高盐胁迫下调控中枢基因
为了揭示高盐胁迫下的关键调控基因，对所有的差异表达 unigenes进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。构建了共表达网络，并用层次聚类法将DE-unigenes分为5个模块。不同的颜色（蓝色、棕色、绿色、绿松石色、黄色）被用来表示不同的模块。其中绿松石色和蓝色模块含有的基因数最多，且参与“转运体活性”、“离子内稳态”和“碳水化合物内稳态”的基因在绿松石模块中，为了揭示高盐胁迫下潜在的关键调控因子，从绿松石色（图4E）和蓝色模块（图4F）中识别出编码SaOST1、SaCIPK10和SaLRRs的蛋白激酶是耐盐调控网络中的枢纽基因。
5 高盐胁迫相关转录因子的全基因组分析
转录因子（TFs）是环境胁迫下重要的基因表达调控因子。在本研究中，使用PlantTFDB（v4.0）分析共发现4997个转录因子的转录本。有趣的是，与拟南芥和水稻相比，大多数的互花米草TF家族都有更多的转录本（图5A），这一结果表明，互花米草TF家族的转录本是扩展的。此外，差异表达的转录因子的数量随着盐浓度的增加而增加，说明高盐胁迫下诱导了互花米草转录因子的基因表达（图5B），但是有些转录因子家族的基因表达量并未增加。总之，这些结果表明高盐胁迫确实诱导了转录因子基因表达，但以基因家族依赖的方式。
6 高盐胁迫下非编码RNA的不同表达模式
非编码RNAs（ncRNAs）已被报道参与了其它植物的胁迫反应。然而，非编码RNA在互花米草中并未被鉴定过。本研究使用CPAT或BLAST将全长转录本与植物非编码RNA数据库（PNRD）进行比较，鉴定出3494 条ncRNAs。进一步分析表明，ncRNAs的平均长度为2723bp，中位长度为2423bp，说明这些ncRNAs可能是长的ncRNAs。在盐度梯度下差异表达的ncRNAs有296个，其中在高盐胁迫下差异表达的ncRNAs有174个。令人惊讶的是，在高盐胁迫下，下调的ncRNAs（113）比上调的ncRNAs（61）多，而在低盐胁迫和中盐胁迫下，没有观察到这种差异（图5E）。这些结果表明高盐胁迫抑制了ncRNAs的表达。
7 高盐胁迫下互花米草与水稻基因表达模式的比较
为了进一步研究盐胁迫下互花米草基因是否具有不同的表达模式，研究者比较了水稻同源基因的表达模式（上调或下调）。为此，对暴露在300mM NaCl中24小时的水稻幼苗进行了RNA-seq分析，然后鉴定差异表达基因。在高盐胁迫下，共有1842个差异表达unigene与水稻差异表达unigene同源，256个差异表达unigene与其水稻同源基因呈明显相反的基因表达模式（图6A）。对这256个基因的GO分析表明，它们主要富集于碳水化合物代谢，特别是细胞壁的生物发生（图6B）。热图分析显示了互花米草和水稻碳水化合物代谢途径相关基因的相反表达模式（图6C）。有趣的是，高盐胁迫可能诱导互花米草中的碳水化合物基因，而抑制水稻中的碳水化合物基因（图6C）。此外，RT-PCR实验还表明，在高盐胁迫下，这些碳水化合物代谢相关基因大多在互花米草中上调，而在水稻中下调（图6D）。这一差异可能为高盐胁迫下互花米草与水稻的不同性状提供了可能的解释。
为了确定互花米草和水稻对高盐条件的转录反应差异，分析了这两个物种中共同的上调或下调基因。在这两个物种的939个共同上调基因中，互花米草更多的基因（615 VS 324）在高盐胁迫下比水稻表达量增加更多（图6E）。同时，在647个共同的下调基因中，互花米草中更多的基因（381 VS 266）在高盐胁迫下比水稻的基因表达量下降更多（图6E）。其次，根据高盐胁迫下基因表达的绝对log2FC将高盐胁迫下的基因表达变化分为三组：（I）1.5-2倍；（II）2-3倍；（III）>3倍（图6F）。对于共同上调基因，更多的水稻基因（161 VS 115）在高盐胁迫下的表达增加了1.5-2倍，而更多的互花米草基因（219>92）在高盐胁迫下的表达增加了3倍以上（图6F）。同样，更多的水稻基因在高盐胁迫下的表达下降了1.5-2倍，而互花米草基因在高盐胁迫下的表达下降了3倍以上（图6F）。综上所述，研究结果表明，互花米草对高盐胁迫的转录反应的表达变化比水稻大。
为了确定这两个物种在转录反应中的功能差异，对每个类别下的共同差异表达基因进行了GO分析。对于共同的上调基因，与胁迫反应（盐胁迫反应、渗透胁迫反应、水胁迫反应和水分剥夺反应）、转录、大分子生物合成和有氧呼吸相关的GO term只在水稻中有较多富集（图6G）。相反，自噬、蛋白质去磷酸化、液泡组织和氨基酸转运是仅在米草中诱导的GO term（图6G）。对于共同的下调基因，与细胞生长（细胞分裂和细胞周期过程）；生长素激活的信号通路、碳水化合物分解过程和冷反应有关的GO term仅在水稻中被抑制（图6H）。有趣的是，互花米草中有更多与翻译相关的基因显著下调下调（图6H）。综上所述，综合比较互花米草和水稻的表达模式，可以为提高水稻的耐盐性提供重要信息。
8 高盐胁迫诱导互花米草全基因选择性剪接
为了研究高盐胁迫是否会影响到互花米草的可变剪切（AS），使用生物信息学工具识别了14058个非冗余AS事件，对应于20431个转录本。约39%（5328/13748）具有多个转录本的unigene与AS事件相关。将近一半（2857/5328）含有AS的unigene具有两个以上的相关AS事件（图7A）。不同AS类型在互花米草中的分布与其他物种的分布相似。内含子保留（IR）是最主要的AS类型（56%）。大多数IR事件（93%）包含典型的GT-AG剪接位点；使用替代受体位点（AltA）分析得到的AS的百分比是替代供体位点（AltD）的两倍（图7B）。
重要的是，与1627个转录本对应的1154个AS事件与盐胁迫有关，约占含AS 事件的unigene的11%（578/5328）。AS事件的数量随着盐度胁迫的增加而增加（图7C），这表明高盐胁迫诱导了互花米草的AS事件。
最后，从互花米草中选择了六个AS事件进行验证（图7D）。在高盐胁迫下，通过RT-PCR和qRT-PCR检测，与这些IR事件相关的转录物水平确实增加了（图7E、F）。总的来说，这些结果表明AS对高盐胁迫有响应。
结论
总之，研究结果为互花米草的耐盐机理提供了一个初步的认识。本研究所鉴定的互花米草全长转录组、可变剪切事件、转录因子、ncRNAs和高盐胁迫相关核心基因，将为今后盐生植物和耐盐植物基因工程的研究提供有用的信息。
评论
世界上超过20%的灌溉土地遭受土壤盐渍化，盐胁迫通过影响植物的发育和繁殖来挑战植物的生存。然而，只有约2%的陆地植物是耐盐的盐生植物，在超过200 mM的NaCl浓度下具有较强的生存能力。互花米草（Spartinaalterniflora）是唯一能在盐沼高盐环境中生存的盐生植物。然而由于其基因组的复杂性，目前对其耐盐机制的分子基础还不清楚。本文结合了三代测序技术（PacbioRSII测序系统）和二代测序（RNA-seq）揭示了互花米草蛋白激酶在高盐耐受调控网络中的关键作用，还鉴定了高盐胁迫相关转录因子、非编码RNA和互花米草特异转录物，研究结果为盐生植物的耐盐调控机制提供了新的见解，也为后续克隆植物相关耐盐基因奠定了基础。
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