科研方法系列 | 科研工作必过之坎：质粒构建

Hello，大家好，今天小编分享的是生物领域常用的质粒的构建，也称分子克隆。说起质粒的构建，我们首先来认识一下什么是质粒，来自于百度百科对质粒的定义：质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中（但酵母除外，酵母的2μm质粒存在于细胞核中），具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。简单来说，质粒是能够自主复制的环状DNA分子。

那么我们构建质粒的目的是什么呢？

细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。通过基因工程手段将需要的外源基因送进受体细胞中去进行增殖和表达。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。比如说，我们研究的基因在癌症细胞中处于低表达的情况，那么我们想研究这个基因在癌症中的功能，这时候我们就需要构建这个基因的重组体，通过外源转入这个基因的重组体来研究其功能。

接下来，我们开始正式详细地介绍构建质粒的过程！目前构建质粒的过程主要分为以下几个步骤：

1.引物设计

2.PCR，p出目的片段

3.酶切

4.连接

5.转化，涂板

6.挑菌，小提

7.酶切验证并测序

8.质粒中提

下面我们将一一进行详细的说明！

1. 引物设计

首先，确认我们所需克隆的目的基因的序列，下面我们以p21（人源）为例进行详细介绍！

打开NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），选择gene，填写P21，单击search（图1），会出现一些result，从中选择人源的P21（CDKN1A）,如图2，选中CDKN1A，可以看到P21的多个转录本，如图3，这里我们选取NM000389.5这个转录本，单击进去，点击CDS如图4,之后会出现图5的界面，点击右下角FASTA，复制图6中的序列于txt格式的文档中。

接下来，选择载体，这里我们以pcmv-myc载体质粒介绍，载体的图片下载自http://www.biofeng.com/zaiti/buru/pCMV-Myc.html，启动子为CMV，载体大小：3791bp，氨苄抗性。图谱右侧的mcs为载体的多克隆位点，我们将要克隆的目的基因序列插入在多克隆位点处。

pcmv-myc载体图谱

下面，我们开始设计引物，所用到的软件是primer5，打开软件，选择file→new→DNAsequence，将我们保存的txt格式中的序列粘贴过来，选择as is→ok，如图8，选择Enzyme，筛选序列中是否含有载体酶切位点的序列，添加pcmv-myc载体多克隆位点，点击ok，如出现图9的界面，则显示无克隆位点序列与目的基因序列重叠，即酶切位点可用。点击primer开始设计引物，S为上游引物,A为下游引物，TM值在60左右，GC含量40-60%，加入选定的酶切位点序列，送公司合成即可。

敲重点：这里有个需要注意的难点，从图谱中可以看到，myc标签蛋白在我们插入的酶切位点前面，即载体先表达myc蛋白在表达P21，所以设计引物时要注意防止移码突变。同时，我们也会使用到目的片段后面加标签蛋白的载体，如Plvsin-egfp质粒，目的片段插入在egfp前面，所以在设计引物时需将序列的终止子去掉，这样才能使得后面的egfp标签蛋白表达。

2. PCR

首先根据需要可选择20μl或者50μl体系，为了下一步回收到较高浓度的片段，常用50μl体系，下面举例酶为primer star：

其中退火温度一般根据Tm值±5摄氏度，可设定梯度退火温度进行PCR，延伸的时间一般根据1000bp/min而定。

PCR完成后，需进行琼脂糖胶电泳，120v 20-30min即可，紫外观察条带的大小是否符合，切胶进行回收，测浓度。

3. 酶切

将PCR回收的目的片段和崽子进行酶切，是目的片段和载体暴露出酶切位点的粘性末端，根据实验室购买的快切酶设定酶切时间，一般设定20μl酶切体系，下面举例EcoR1，xhoI双酶切位点酶切体系：

酶切产物进行琼脂糖电泳，120v 20-30min即可，纯化酶切产物。

4. 连接

根据实验室所选连接体系而定，下面以T4连接举例

5. 转化，涂板

DH5α菌株是实验室最常用的感受态细胞，首先将感受态细胞于-80℃冰箱拿出，迅速插入病种，待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物），并用手拨打EP管轻轻混匀，避免用枪吸打，冰中静止25min，后42℃热激1min，迅速放回冰上并静止2min，此步骤尽量减少晃动以免降低转化效率，向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min，后5000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右的上清轻轻吹打重悬菌块并涂布于含相应抗生素的固态培养基上，将平板倒置于37℃培养箱过夜。

注意：平板在37℃培养箱中12h即可，不宜过长，过长易形成微型菌落。

6. 挑菌，小提

将过夜后的平板拿出，选取大而饱满的菌落，可用镊子夹取白枪头轻轻扎取白色菌落，于5-7ml的无菌培养基中，加入相应的抗生素，37℃ 200rpm 过夜，一般不能超过16h，参照质粒小提试剂盒进行提取，测定浓度。

7. 酶切验证并测序

将小提的质粒进行酶切验证，酶切体系同第3步，确认琼脂糖胶的切出的条带与所用载体和所需克隆的目的片段位置是否一致，并送样于测序公司进行测序。

8. 质粒中提

经公司测序确认克隆的质粒序列正确后，可参照实验室购买的中提试剂盒提取，进一步通过外源导入到细胞中进一步验证。

以上就是质粒构建的基本过程啦，希望对大家能有所帮助，如果对质粒的构建方面感兴趣，欢迎在推文下方留言，同时小编会根据大家的反馈，对大家的提问和需要进行更进一步的说明和补充。最后，祝愿在科研之路的小白和大牛们都能顺顺利利，如果您觉得资源对您有所帮助，请多多转发，以帮助更多需要帮助的人!

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