缰核外侧的星形胶质细胞Kir4.1在抑郁症中驱动神经元放电
在之前的实验中作者发现，在抑郁症动物模型中，外侧缰核（LHb）神经元的放电活动增强对驱动抑郁症样行为至关重要，LHb的放电导致抑郁样行为，是快速抗抑郁药氯胺酮的一个突出靶点。然而，LHb神经元这种增强的放电的原因仍然是未知的。
胡海岚团队的研究成果提示了一个新的抑郁模型：在外界压力刺激下，大脑的“反奖赏中心”－外侧缰核－中胶质细胞Kir4.1离子通道表达上调，造成神经元胞外钾离子浓度的下降，促使神经元由单个放电转化为簇状放电模式，进而造成对下游奖赏中心（包括腹侧被盖区VTA与中缝背核DR）的过度抑制，进而导致了快感缺失与行为绝望等抑郁表型。新型抗抑郁药物氯胺酮能够有效阻断外侧缰核的簇状放电从而起到快速抗抑郁的作用。
在该实验中，利用高通量定量蛋白质组学筛选，表明在抑郁症大鼠模型中，星形胶质细胞钾通道（Kir4.1）在LHb中上调。LHb中的Kir4.1在紧紧包裹神经元胞体的星形细胞膜过程中显示出独特的表达模式。电生理和模型数据显示，星形胶质细胞Kir4.1水平对LHb神经元膜超极化程度和放电活动量有密切的调节作用。LHb中Kir4.1的星形胶质细胞特异性的获得和丢失，双向调节神经元破裂和抑郁样症状。总之，这些结果表明，在一种主要的精神疾病模型中，LHb体周间隙的胶质-神经元相互作用参与了神经元放电模式的调控。LHb中的Kir4.1可能作为治疗抑郁症的靶点。
1、抑郁症大鼠的LHb-Kir4.1上调
Kir4.1在cLH大鼠缰核中高度上调。Western blot分析证实cLH大鼠缰核膜蛋白组分中Kir4.1显著增加。相比之下，另一种星形胶质细胞特异性蛋白，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达没有变化，表明没有星形胶质细胞增生。为了测试Kir4.1上调是否在抑郁症中普遍存在，作者检查了用脂多糖（LPS）治疗诱导抑郁症的大鼠。LPS注射1周足以引起强烈的抑郁样表型和糖水偏好试验（SPT）。LPS诱导的抑郁大鼠在松果体缰中Kir4.1也显著增加。定量实时PCR显示cLH大鼠松果体缰的Kir4.1（也称Kcnj10）mRNA水平增加，表明蛋白质水平的部分变化是由于转录上调所致。
为了证实Kir4.1在大鼠抑郁模型中确实有功能的上调，作者对cLH或野生型大鼠LHb星形胶质细胞进行了全细胞膜片钳记录，结果与预计相一致。然后，作者用Ba2+溶液，选择性地阻断亚毫摩尔浓度下的Kir通道，分离Kir4.1电流，发现在出生后，cLH and LPS处理的大鼠LHb星形胶质细胞中Ba2+敏感电流几乎翻了一番。但值得注意的是，cLH大鼠在P30时Kir4.1电流和蛋白质水平的增加并不明显。在这个年龄，cLH大鼠并不能表现出FST和习得性无助测试的抑郁样结果，表明Kir4.1的上调伴随着抑郁症样症状的发展。
Fig 1 Kir4.1在大鼠抑郁模型LHb中上调
2、星形胶质细胞上的Kir4.1包围神经元胞体
为了证实Kir4.1定位于星形胶质细胞而不是LHb中的神经元，作者将表达Cre重组酶的AAV病毒注射到Kir4.1 flox(Kcnj10f/f ) 小鼠的神经元Camk2a启动子或胶质GFAP(gfaABC1D)启动子下，分别在神经元或星形胶质细胞中敲除Kir4.1。Kir4.1表达的神经元敲除并没有改变Kir4.1染色的模式，但是星形胶质细胞的敲除完全消除了它。电子显微镜成像显示Kir4.1阳性金颗粒包围了神经元胞体膜和突触。同样，全细胞膜片钳记录显示，Ba2+敏感电流在LHb神经元中缺失，但在星形胶质细胞中丰富。这些结果表明Kir4.1主要表达于LHb中紧紧包裹神经元胞体和突触的星形胶质细胞过程中。
Fig 2 在LHb中，Kir4.1在紧紧包裹神经元体细胞的星形细胞突起上表达
3、Kir4.1功能增强导致抑郁
为了测试Kir4.1在LHb中上调的结果，作者使用2/5血清型（AAV2/5）腺相关病毒（优先针对星形胶质细胞）和人类GFAP启动子一起传递eGFP标记的Kir4.1通道（AAV-GFAP:：Kir4.1）或单独的eGFP（AAV-GFAP:：eGFP）作为对照。在P50处双侧注射LHb后21天，AAV2/5介导的病毒转染导致整个LHb星形胶质细胞中Kir4.1和eGFP的表达。NeuN和eGFP联合免疫染色证实了病毒感染星形胶质细胞的特异性：只有0.3%的NeuN+细胞被病毒感染。作者在冠状面LHb切片中对星形胶质细胞或病毒转染的星形胶质细胞周围的神经元进行全细胞膜片钳记录。感染AAV-GFAP：：Kir4.1的小鼠星形胶质细胞和神经元的RMP均呈超极化，神经元破裂的百分率明显高于感染AAV-GFAP：：eGFP的小鼠。然后，作者分析了抑郁样表型，发现在LHb中感染AAV-GFAP:：Kir4.1的小鼠表现出严重的抑郁样行为，包括FST中的不动持续时间增加和不动潜伏期减少，SPT中的糖水偏好减少，而一般运动量没有变化。
Fig 3 星形胶质细胞Kir4.1的过度表达增加了LHb中的神经元放电，并导致抑郁症样表型
4、Kir4.1调节神经元RMP和放电
星形细胞K+通道如何调节LHb神经元的RMP和突发放电？作者假设，在神经元胞体和Kir4.1阳性星形胶质细胞过程之间高度封闭的细胞外空间内，LHb固有活性神经元不断释放的K+通过Kir4.1依赖机制被星形胶质细胞迅速清除。因此，作者预测，阻断Kir4.1会损害K+的空间缓冲，导致细胞外K+([K]out)增加，使神经元的RMPs去极化。与这一预测一致，BaCl2浴灌流阻断Kir4.1约10min可使LHb神经元的RMP去极化。RMP的变化程度与神经元的原始放电率呈正相关，表明神经元越活跃，K+缓冲对RMP的贡献越大。在突触传递阻断剂存在的情况下，当BaCl2被应用时，产生了类似数量的RMP变化，这表明在LHb神经元中，依赖Kir4.1的RMP调节主要发生在神经元胞体上，而不是突触上。随着RMP的变化和[K]out的积累，BaCl2的灌注引起了放电模式的改变，即从突然放电到强直放电并最终停止神经元活动，或在突然放电中延长平台电位并最终停止突然放电。
相反，Kir4.1的上调或神经元放电的抑制应减少[K]out的输出和超极化神经元RMP。星形胶质细胞中Kir4.1的过度表达或河豚毒素对神经元动作电位的阻断导致LHb神经元的超极化。星形胶质细胞中Kir4.1的过度表达也增加了神经元的放电。这些结果表明，Kir4.1过度表达导致的细胞外K+清除增强可能是放电起始所需的神经元超极化的基础。
Fig 4 依赖Kir4.1的钾缓冲调节LHb神经元RMP和放电
5、Kir4.1功能丧失缓解抑郁症
为了确定LHb中Kir4.1功能的丧失是否能减少神经元放电和逆转抑郁表型，作者设计了两种策略。作者使用AAV2/5病毒载体在cLH大鼠LHb中表达短发夹RNA（shRNA）以降低Kir4.1的水平，或表达显性阴性结构以阻断其功能。作者首先研究了Kir4.1-shRNA对神经胶质和神经电生理特性的影响。在感染AAV-H1：：Kir4.1-shRNA的星形胶质细胞中，作者观察到与感染对照shRNA的星形胶质细胞相比，电流-电压（I-V）关系发生了显著变化，41mV的去极化，这与Kir4.1主要负责设置星形胶质细胞RMPs24的先前发现相一致。感染AAV H1：：Kir4.1 shRNA的神经元的RMPs与未感染的相邻神经元的RMPs无差异。然而，在AAV H1：：Kir4.1-shRNA感染的脑切片中，邻近LHb神经元的RMP总体上更去极化。
与对照shRNA感染的大鼠神经元RMPs相比，提示星形胶质细胞Kir4.1基因敲除对邻近神经元RMPs有广泛影响。在感染AAV-GFAP：：dnKir4.1的LHb切片中也观察到类似的作用。值得注意的是，感染AAV-H1:：Kir4.1-shRNA或AAV-GFAP:：dnKir4.1可消除cLH大鼠LHb中的放电活性。行为学上，感染AAV-H1:：Kir4.1-shRNA或AAV GFAP:：dnKir4.1可显著降低抑郁样症状。
cLH大鼠在三种抑郁模式下的表型：FST中的不动性降低，LHT中的压条次数增加，SPT中的糖水偏好增加。LHT中的行为得分与FST中的行为得分相关。
Fig 5 LHb中Kir4.1功能的缺失降低了cLH大鼠的神经元破裂，缓解了抑郁症样表型
作者描述了Kir4.1在调节LHb高度特化的神经元-胶质细胞界面的神经元RMP和放电模式中的一个重要功能。在抑郁症期间，Kir4.1的上调可能导致细胞外K+清除增强，导致[K]out输出减少和神经元超极化。神经元超极化可使T型电压敏感性钙通道（T-VSCC）失活，进而引发NMDAR依赖性猝灭，从而增加对下游单胺能中枢的抑制。这些结果可能会激发针对LHb中不适应神经元-胶质细胞相互作用的抑郁症新疗法的发展。
所涉及的行为学
习得性无助测验(LHT)：用杠杆按压法检测雄性幼鼠(P30)和成年鼠(P90)的习得无助(cLH)表型。在冲击室中设置一个提示灯光照明的杠杆，当大鼠按下杠杆时，电击终止。15次可避免电击(0.8mA)，电击间隔24 s。每次电击持续60秒，除非大鼠按下杠杆终止电击。在15次试验中，10次以上未按下控制杆的大鼠被定义为习得性无助(LH)，失败次数少于5次的大鼠被定义为非习得性无助(NLH)。
糖水偏好实验（SPT）：动物们被单独饲养，正常饮水2天2瓶，然后是2天2瓶2%的蔗糖。之后动物被剥夺24小时的水，然后在黑暗阶段被暴露在一瓶2%的蔗糖和一瓶水中2小时。1小时后切换瓶位。测量每种液体的总消耗量，并将蔗糖偏好定义为第一和第二小时内的平均蔗糖消耗比例。蔗糖消耗比是用蔗糖的总消耗量除以水和蔗糖的总消耗量。
强迫游泳实验（FST）：将动物单独放置在盛有水（23-25°C）的圆筒（直径：12cm，小鼠身长：25cm；直径20cm，大鼠身长：50cm）中，正常光线下游6min。水深的设置是为了防止动物用尾巴或后肢接触到底部。从侧面记录动物的行为。采集参数：最后4min强迫游泳测试中的不动时间。不动时间被定义为动物漂浮或静止，只保持水中保持平衡所需时间。若实验对象为大鼠，在实验前24小时需进行预试验，条件如上所述，时间为15min。对于光遗传学操作，将小鼠置于水中后立即进行激光刺激，时间为6min。为尽量减少光遗传学电缆对游泳行为的影响，需调整电缆的长度，使电缆只接触水面。
旷场实验（OFT）：动物被放置在一个昏暗光线房间的箱体中心（小鼠：40cm×40cm×40.5cm，大鼠：100cm×100cm×50cm），箱体正上方的摄像机用来跟踪每只动物的运动情况。在昏暗灯光下放置10min并记录。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/nature25752
（山东中医药大学中医药与脑科学研究创新团队 邢影 供稿）