怎样才能让mRNA疫苗在体内稳定表达？Moderna和BioNTech的秘技：假尿嘧啶修饰

mRNA 疫苗从体外注射到体内，会引起一系列免疫反应，就像是身体在对抗病毒入侵一般。对此 Moderna 和 BioNTech 利用假尿嘧啶修饰 mRNA 解决上述问题，以保证其在体内稳定表达。

生辉之前分析了 mRNA 疫苗的关键技术。（点击查看《mRNA疫苗的三道必答难题：递送、给药、专利》）mRNA 成药还得解答一道附加题——能让其体内稳定表达的修饰过程。

“修饰”的必要性

生产 mRNA 疫苗过程中的酶促反应会生成一些双链 RNA，产生应激反应，最终导致翻译抑制和 mRNA 降解。对制备的 mRNA 进行纯化，减少双链副产物，减少免疫反应。单链 RNA 本身也是一种 PAMP，能够引起 I 型干扰素产生。

目前已有多种修饰技术被用于产生更稳定的 mRNA。1）用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成 mRNA；2）加上 5’帽子、3’ poly(A)“尾巴“和 UTR （untranslated region）序列；3）利用特殊的新型制剂技术，有效地保护 mRNA。

图丨 mRNA 修饰途径方法（来源：Cell）

具体作用效果如下：

1）合成 “帽子” 类似结构和“加帽酶（capping enzymes）” 来稳定 mRNA，通过与真核翻译起始因子 4E（eukaryotic translation initiation factor 4，EIF4E）的结合来增强蛋白质的翻译；

2）在 5’和 3’UTR 区域增加可调控序列，稳定 mRNA；

3）修饰 Poly（A）“尾巴”，稳定 mRNA，增强蛋白质翻译；

4）修饰核苷酸，减少先天免疫激活；

5）分离和（或）纯化技术：利用 RNase III 处理和快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography，FPLC）纯化，降低免疫激活并提高翻译率；

6）优化序列和密码子，选择与 tRNA 同源的密码子，提高翻译率；

7）靶细胞的调节：翻译起始因子和其他方法的共同递送，优化翻译和免疫原性。

大厂利器：假尿嘧啶修饰

化学修饰是调节生物大分子功能特异性的方法，并涉及多种疾病的治疗（包括癌症等）。现有研究表明，在 RNA 中已显示存在着 150 多种不同类型的合成后修饰，RNA 的 4 种碱基以及核糖都可以成为修饰的靶标。换句话说，此种方式用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成 mRNA，从而大大降低其固有的免疫原性和不稳定性。

其中，在真核生物 mRNA 上发现的修饰总共有 16 种，其中有 13 种修饰已被 RNA 修饰数据库（RNA Modification Database， RNAMDB）收录，这些修饰可以分为甲基化、假尿嘧啶化和次黄嘌呤三类。对哺乳动物内部的 mRNA 修饰主要围绕 N1 - 和 N6 - 甲基腺苷（m1A，m6A），3 - 和 5 - 甲基胞嘧啶（m3C，m5C），5 - 羟甲基胞嘧啶（hm5C），假尿苷 (Ψ) 和 2'-O - 甲基化（Nm）等。

在 mRNA 疫苗研发过程中，主要的修饰方法是 N6 - 甲基腺苷、假尿苷 (Ψ) 和 2'-O - 甲基化（Nm）。N6 - 甲基腺苷（m6A）起到调节 mRNA 稳定性的作用。而人体对 mRNA 疫苗的免疫反应主要和尿苷 (部分由尿嘧啶组成)有关，利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能够减少免疫系统对 mRNA 的识别，RNA 5' 帽子的 2'-O- 甲基化修饰可以使其逃脱宿主的抗病毒应答。

mRNA 疫苗“大厂”Moderna 和 BioNTech 都是利用假尿嘧啶修饰保持 mRNA 的稳定性。

假尿嘧啶修饰是最丰富的 RNA 修饰，一般由尿苷的异构化产生，已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。mRNA 假尿嘧啶化修饰的过程是由假尿嘧啶合成酶（pseudouridine synthases，PUS）进行催化，让尿嘧啶核苷酸（U）化学结构发生改变，形成假尿嘧啶核苷核苷酸。之前研究已在 tRNA、rRNA、snRNA 中发现了大量的假尿嘧啶，最近的研究证实假尿嘧啶同样存在于 mRNA 中。

2011 年，Karijolich 等发现，mRNA 上的假尿嘧啶化修饰可以改变密码子。将酵母中的密码子中的尿嘧啶 (U) 替换为假尿嘧啶，这些密码子就能编码氨基酸，2014 年，Schwartz 等发现，酵母发生热休克时，会由 Pus7p（一种蛋白） 额外引入超过 200 个假尿嘧啶修饰位点，如果敲除 PUS7 基因，则那些含有新引入修饰的 mRNA 会减少，这说明着假尿嘧啶修饰可能会增强转录本稳定性。

Moderna 在成立之初，其创始人之一 Derrick Rossi 将 RNA 中的尿嘧啶、胞嘧啶替换为假尿嘧啶、5 - 甲基胞嘧啶，修饰后的 RNA 更像是细胞内源性物质，从而克服天然免疫应答（现已经发展到第六代）。这种 RNA 修饰方法并不是 Rossi 首创，发明人是宾夕法尼亚大学的 Katalin Karikó 和 Drew Weissman，关于这项修饰技术归属权问题，也一直是 Moderna 的受争议的原因之一。

图丨 Moderna 官方并没有给出太多技术平台的细节（图片来源：Moderna 官网）

2017 年 9 月，BioNTech 获得 CELLSCRIPT 公司的核苷修饰 RNA 技术的使用许可，修饰的的方式也是假尿嘧啶修饰，目前 CELLSCRIPT 公司的修饰产品已经在多个国家售卖，应用广泛。

参考：

Cantara WA, Crain PF, Rozenski J, et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Res, 2011, 39: D195-201

Li S, Mason CE. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2014, 15: 127-50

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